羅忠圣， 錢志瑤， 周 鎂， 黃秀平， 桂珊珊， 覃容貴*

（1.貴州康琦藥械有限公司，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽550004）

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正交試驗優(yōu)選二巖虎果湯的水提醇沉工藝

羅忠圣1， 錢志瑤2， 周 鎂2， 黃秀平2， 桂珊珊2， 覃容貴2*

（1.貴州康琦藥械有限公司，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽550004）

摘要：目的 優(yōu)選二巖虎果湯的水提醇沉工藝。方法 以石吊蘭素含有量和浸膏得率的綜合評分為指標，采用正交試驗考察加水量、提取次數(shù)、提取時間對水提工藝的影響，再考察藥液濃縮比例、乙醇沉降體積分數(shù)、靜置時間對醇沉工藝的影響。然后，進行水提醇沉工藝及藥效學驗證。結果 最佳提取工藝是加10倍量水，提取1次，每次1 h；最佳醇沉工藝是提取液減壓濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，加入乙醇量為75％，靜置12 h后除去沉淀。結論 該工藝所得產品與二巖虎果湯水提液的止咳抗炎作用無差異，而且穩(wěn)定可行，不影響藥效，可為其規(guī)范化生產提供參考。

關鍵詞：二巖虎果湯；水提醇沉工藝；石吊蘭素；浸膏得率；正交試驗；止咳抗炎作用

二巖虎果湯復方的單味藥均為苗藥，由君藥巖豇豆、臣藥巖白菜、佐藥虎杖、使藥果上葉組成，為貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院名老中醫(yī)饒?zhí)炫嘟涷灧?，四味藥配伍合用時性涼，具有辛良解表、宣肺、補虛、化痰止咳、清血熱、解毒、養(yǎng)陰清肺等功效，可止咳、祛痰、平喘、抗炎，臨床主要用于治療大葉性肺炎、急性支氣管炎、小兒哮喘等，未見不良反應。為了將傳統(tǒng)的二巖虎果湯水煎劑開發(fā)為現(xiàn)代中藥制劑，本實驗采用正交試驗法對其水提醇沉工藝進行研究，結果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agi1ent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；R308旋轉蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；HZT-A500、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；98-1-C數(shù)字控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；AS系列超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 材料 石吊蘭素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111555-200602，20 mg）。甲醇為色譜純（天津科密歐化學試劑有限公司）；水為色譜純（自制）；其他試劑為分析純。巖豇豆、巖白菜、虎杖、巖果藥材均購自貴州省貴陽市萬東橋中藥材市場，經貴陽醫(yī)學院藥學院覃容貴教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 石吊蘭素的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取石吊蘭素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg石吊蘭素的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取藥材適量，水提或水提醇沉后，將提取液置于旋轉蒸發(fā)儀中濃縮成流浸膏，水浴蒸干，105℃恒溫干燥箱中干燥3 h，制成浸膏。再精密稱取浸膏粉末0.5 g，研細，置于具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（240 W、40 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，75％甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例（不含巖豇豆）稱取藥材適量，按“2.1.2”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗 采用Diamonsi1（R）鉆石C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），包括VWD檢測器；流動相為甲醇-水（50∶50）；檢測波長330 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按石吊蘭素峰計算，應不小于3 000。

在選定色譜條件下，取對照品、供試品、陰性對照品溶液各10 μL分別進樣。結果，測得石吊蘭素對照品的保留時間約為69.9 min；供試品色譜中石吊蘭素峰與雜峰的分離效果良好，分離度大于2.0；理論塔板數(shù)按石吊蘭素峰計算，應不小于3 000；陰性對照色譜在相應位置上，無干擾峰產生，具體見圖1。

圖1　二巖虎果湯的HPLC色譜圖

2.1.5 線性關系考察 精密移取標準品母液（50 μg/mL）1、2、3、4、5 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，微孔濾膜過濾，在“2.1.4”項色譜條件下測定石吊蘭素峰的峰面積。以色譜峰面積為縱坐標（y），石吊蘭素質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程y=29.324x-6.1，r=0.999 7，表明石吊蘭素對照品在5～25 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，重復進樣6次，記錄峰面積。結果，其RSD為0.38％，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同批浸膏粉末0.5 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測定，計算石吊蘭素的含有量。結果，浸膏中石吊蘭素的平均含有量為15.85 μg/mL，RSD 為0.66％，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取供試品溶液（16.0 μg/mL）10 μL，注入液相色譜儀，記錄石吊蘭素的峰面積。結果，其RSD為1.12％，表明石吊蘭素溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收試驗 精密稱取同一批樣品9份，每份0.25 g（含石吊蘭素1.42 mg/g），分為3組，分別精密加入質量濃度為60、70、80 μg/mL的石吊蘭素對照品溶液5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果，平均回收率為99.72％，RSD為1.12％（n =9）。

2.1.10 樣品的測定 精密稱取正交試驗所得的浸膏樣品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。每份樣品測定兩次，按回歸方程計算，以平均值為測定值，計算樣品中石吊蘭素的含有量。

2.2 正交試驗優(yōu)化水提醇沉工藝

2.2.1 水提工藝設計［1-2］以加水量、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，以石吊蘭素含有量和浸膏得率為考察指標，選用L9（34）正交表進行試驗設計，因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平

2.2.2 水提工藝正交試驗結果及統(tǒng)計分析 以表2中的L9（34）設計表進行9組試驗，以石吊蘭素含有量和浸膏得率為指標，同時以兩者的最大值為參照進行數(shù)據歸一，得出權重系數(shù)。將石吊蘭素含有量的權重系數(shù)設為0.7，由于原二巖虎果湯方中有效成分不明確，通常以浸出物得率為指標，因此將其權重系數(shù)設定為0.3，進行統(tǒng)計分析。水提正交試驗結果及直觀分析結果見表2，方差分析結果見表3。綜合評分M=0.7X×100/2.256 +0.3Y×100/26.307。

表2　水提工藝正交試驗結果

表3　水提工藝正交試驗方差分析

從直觀分析中的極差大小來看，其影響因素順序為提取時間（C）＞加水量（A）＞提取次數(shù)（B）。比較各因素不同水平綜合評分的均值發(fā)現(xiàn)，對于因素C，其優(yōu)劣次序為3＞2＞1；對于因素A，其優(yōu)劣次序為3＞2＞1；對于因素B，其優(yōu)劣次序為1＞2＞3。

從方差分析結果來看，由于F0.05（2，2）=19，提取時間（C）、加水量（A）和提取時間（B）均無統(tǒng)計學意義，可能是由于石吊蘭素為醇溶性物質，在水溶液中的溶解度較低所致。綜合考慮，確定最優(yōu)提取方案為A3B1C3，即加水量12倍，提取1次，每次2 h。

2.2.3 醇沉工藝設計［3-5］以醇沉濃度、藥液濃縮比例和靜置時間為考察因素，以石吊蘭素含有量、浸膏得率為考察指標，采用L9（34）正交試驗對醇沉工藝進行優(yōu)選，因素水平見表4。

表4　醇沉工藝正交試驗因素水平

2.2.4 醇沉工藝正交試驗結果及統(tǒng)計分析 將石吊蘭素的權重系數(shù)設為0.7，浸膏得率的權重系數(shù)設為0.3，進行統(tǒng)計分析。醇沉正交試驗結果及直觀分析結果見表5，方差分析結果見表6。綜合評分M=0.7X×100/2.478 +0.3Y× 100/24.217。

表5　醇沉工藝正交試驗結果

表6　醇沉工藝正交試驗方差分析

從直觀分析中的極差大小來看，其影響因素順序為醇沉濃度（B）＞藥液濃縮比例（A）＞靜置時間（C）。比較各個因素不同水平綜合評分的均值發(fā)現(xiàn)，對于因素B，其優(yōu)劣次序為2＞3＞1；對于因素A，其優(yōu)劣次序為3＞2＞1；對于因素C，其優(yōu)劣次序為2＞3＞1。

從方差分析來看，由于F（1，2）=19，醇沉濃度（B）相對于藥液濃縮比例（A）和靜置時間（C）有統(tǒng)計學意義。綜合考慮，因A（藥液濃縮比例）、C（靜置時間）對結果無顯著性影響，而且各水平相近，故考慮實際情況，確定最優(yōu)提取方法為A3B2C1，即提取液濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，醇沉濃度為75％，靜置12 h。

2.2.5 水提醇沉工藝驗證 按處方比例，稱取1/10處方量藥材3份，即巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各3 g，剪碎混合，按優(yōu)選的水提醇沉工藝進行3次驗證試驗，即加12倍量水，提取1次，每次2 h，提取液減壓濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，加入乙醇量75％，靜置12 h。濃縮后，置于105℃恒溫干燥箱中干燥3 h，再置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱重，計算浸膏得率，測定其中石吊蘭素的含有量，結果見表7。由表可知，按最佳水提醇沉方案試驗，浸膏得率可控制在21％左右，石吊蘭素含有量大于2.2 mg/g，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表7　驗證實驗結果

2.3 水提醇沉工藝的藥效學驗證

2.3.1 樣品的制備

原水提組：取巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各30 g，加10倍量水加熱煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液并濃縮，即每1 mL濃縮液相當于藥材量1 g，備用。

水提醇沉組：取巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各30 g，按水提醇沉工藝優(yōu)選條件制備樣品，濾液濃縮，回收乙醇，即每1 mL濃縮液相當于藥材量1 g，備用。

2.3.2 藥效學考察 止咳試驗［6-8］：取小鼠30只，分為模型對照組、原水提組、水提醇沉組，每組10只，按20 mL/kg劑量分別灌胃給藥，其中模型對照組給予同體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥1 h后，依次將小鼠置于噴霧器中，濃氨水恒壓定量噴霧10 s，立即取出，觀察小鼠是否腹肌收縮并同時張開大口，以此為標準，計咳嗽一次，統(tǒng)計小鼠開始咳嗽的時間（咳嗽潛伏期）。同時，繼續(xù)觀察并記錄3 min內小鼠的咳嗽次數(shù)。

抗炎試驗［9-11］：取小鼠30只，分組及給藥方法同上。第7天給藥40 min后，依次在小鼠右耳的兩面分別涂以0.04 mL二甲苯致腫，其中正常對照組為小鼠左耳，1 h后處死，分別在小鼠正常對照組左耳和二甲苯右耳的同一部位，用直徑5 mm的打孔器打下耳片，分別稱定質量，記錄，計算耳腫脹率，公式為腫脹率=（右耳質量-左耳質量）/左耳質量。

鎮(zhèn)咳、抗炎實驗結果分別見表8、表9。由表可知，與模型對照組比較，水提醇沉組具有明顯的延長小鼠咳嗽潛伏期、減少咳嗽次數(shù)、抑制小鼠耳腫脹率的作用（P＜0.05）；與原水提組比較，水提醇沉組療效無顯著性差異（P＞0.05）。

表8　水提醇沉組對濃氨水致小鼠咳嗽的影響（±s，n=10）

表8　水提醇沉組對濃氨水致小鼠咳嗽的影響（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05；與原方組比較，▲P＞0.05，下同。

組別　　劑量/（g.kg-1）咳嗽潛伏期/s 3 min內咳嗽次數(shù)模型對照組　　—　16.00±1.94　 50.50±8.22原水提組 　10　84.50±9.43*　14.00±3.37*水提醇沉組　10　87.10±8.44*▲12.50±2.80*▲

表9　水提醇沉組對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s，n= 10）

表9　水提醇沉組對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s，n= 10）

組別　　劑量/（g.kg-1）　　腫脹率/％模型對照組　　—　168.6±6.3原水提組　10　50.1±10.1*水提醇沉組　10　52.1±2.3*▲

3 討論

巖豇豆（又名石吊蘭）是二巖虎果湯的君藥，而石吊蘭素為巖豇豆的有效成分，研究表明其具有良好的鎮(zhèn)咳、抗炎等作用［12］，與復方二巖虎果湯的功能主治一致，所以本實驗選擇石吊蘭素作為二巖虎果湯水提醇沉工藝的含有量測定指標。為考察提取是否完全，除石吊蘭素含有量外，還應兼顧浸膏得率，鑒于前者比后者能更好地反映藥材的提取情況，故設計兩者的權重系數(shù)為7∶3。

據報道，單味石吊蘭藥材在流動相為甲醇-1％醋酸（85∶15），檢測波長為335 nm時，石吊蘭素的出峰時間為10.2 min［13］。本實驗參照藥典標準，以甲醇-水（68∶32）為流動相［14］，標準品石吊蘭素的出峰時間為11.9 min，但供試樣品出峰雜亂，未分離出石吊蘭素的色譜峰。考慮到研究對象為復方，成分復雜，主峰前面有雜峰，分離度達不到要求，因此調整了流動相比例。最終，確定以甲醇-水（50∶50）為流動相時，石吊蘭素的出峰時間為69.9 min，雖然出峰時間偏長，但分離效果良好，而且該比例下流動相經多次重復試驗證明，其分離效果和出峰時間穩(wěn)定，因此予以采用。

由于本方各味藥材含多糖、淀粉量較多，水提浸膏得率較高，會導致給藥劑量過大，而且這些雜質還可能造成制劑不穩(wěn)定，所以后續(xù)進行了醇沉除雜工藝研究。結果顯示，藥液的相對密度在實際操作中不易控制，故以藥材量與藥液的體積比代替，方便實用。

另外，二巖虎果湯的傳統(tǒng)劑型為水煎劑，為確保水提醇沉工藝不影響其療效，本實驗進行了藥效學驗證。結果表明，水提醇沉工藝產品與水煎劑比較，止咳、抗炎作用無差異，進一步說明該工藝的可行性。

參考文獻：

［1］ 李 旸，廖秋紅，許明旺，等.貞清膠囊的水提醇沉工藝探討［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（8）：619-621.

［2］ 崔佳麗，山麗梅，趙艷玲，等.治療乙肝相關性腎炎新藥大黃甘草膠囊提取工藝優(yōu)選［J］.中成藥，2013，35（6）：1333-1335.

［3］ 黃榮增，陶 群，汪 琦，等.小兒麻藤定喘方有效成分群的水提醇沉工藝研究［J］.中國藥業(yè)，2011，20（15）：37-39.

［4］ 姜玲艷，張小華，張宏武，等.正交試驗法優(yōu)選健胃清腸合劑的水提醇沉工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19 （17）：35-37.

［5］ 李天辰，沈 侃，韓 偉.益氣散聚方的水提醇沉工藝研究［J］.中成藥，2012，34（11）：2257-2261.

［6］ 鄭軼楓，黃 萍，吳清和，等.咳喘順丸止咳化痰作用實驗研究［J］.中藥與臨床，2013，4（2）：42-45.

［7］ 高富紅，郭亞楠.芩黃口服液止咳平喘作用研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47（10）：33-34.

［8］ 李 聰，惠 瑯，白 斌，等.腌制沙芥提取物鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳活性研究［J］.西北大學學報，2010，40（6）：996-998.

［9］ 任澤明，戴關海，童曄玲，等.三葉青凍干粉抗炎作用的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（30）：13-14.

［10］ 冷 嫚，楊丹莉，夏 文，等.痛風舒緩膠囊抗炎鎮(zhèn)痛作用研究［J］.遵義醫(yī)學院學報，2012，35（1）：24-26.

［11］ 甘 雨，喬 敏，張 宏，等.抗病毒片的止咳祛痰作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：466-467.

［12］ 楊曉燕，鄒 勇.石吊蘭素的研究進展［J］.凱里學院學報，2008，26（6）：47-49.

［13］ 王紹云，周光明，黃 成，等.反相高效液相色譜法測定吊石苣苔中石吊蘭素的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26 （11）：1617-1619.

［14］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版二部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：84.

*通信作者：覃容貴（1970—），女，博士，教授，主要從事中藥資源及藥理研究。Te1：（0851）6908218-709，E-mai1：1346812934@ qq.com

作者簡介：羅忠圣（1971—），男，副主任藥師，主要從事中藥制藥及新藥研究工作。Te1：13885086747，E-mai1：1052318167 @ qq.com

基金項目：貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2012］2328號）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術研究課題（QZYY2011-86）

收稿日期：2014-09-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.047

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0193-05