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        星點設計-效應面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝

        2016-04-05 06:59:16夏新華賀蘭芝曾建國劉艷科
        中成藥 2016年1期
        關鍵詞:提取工藝浸膏多糖

        杜 陽, 夏新華*, 賀蘭芝, 曾建國, 劉艷科

        (1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南長沙410208;2.長沙市中心醫(yī)院,湖南長沙410004)

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        星點設計-效應面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝

        杜 陽1, 夏新華1*, 賀蘭芝1, 曾建國2, 劉艷科2

        (1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南長沙410208;2.長沙市中心醫(yī)院,湖南長沙410004)

        摘要:目的 用星點設計-效應面法優(yōu)選精白霧化吸入液的最佳提取工藝。方法 在單因素試驗的基礎上,以浸泡時間、加水量、提取時間為自變量,以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為評價指標,用效應面法選擇最佳提取工藝。結果 確定精白霧化吸入液的最佳提取工藝為加水浸泡1.5 h,回流提取2次,加水量分別為10、8倍,提取時間分別為2.5、2.0 h。結論 星點設計-效應面法優(yōu)選出的提取工藝簡單、穩(wěn)定,預測性良好,可為精白霧化吸入液的工業(yè)化生產提供實驗依據(jù)。

        關鍵詞:精白霧化吸入液;多糖;浸膏;星點設計-效應面法;提取工藝

        精白霧化吸入液由黃精、白及兩味中藥組成,具有益肺、殺蟲、化瘀新生之功效,臨床以霧化吸入方式給藥,對治療肺結核具有一定療效。方中黃精、白及所含多糖為本制劑的主要活性成分,其藥理作用已有大量文獻報道[1 -3],具有增強免疫力、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。為提高本制劑的質量,確保臨床治療效果,本實驗根據(jù)多糖的性質,采用水煎煮法進行提取,并以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為指標,用星點設計-效應面法對提取工藝進行了優(yōu)選。

        1 材料

        1.1 儀器與設備 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);DK-98 -Ⅱ型水浴鍋、98 -1 -B型電子調溫電熱套(天津市泰勒特儀器有限公司);SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵、RE-52型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6020AB型真空干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);YD601N型電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)。

        1.2 試藥 無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110833-201205)。黃精、白及(湖南三湘中藥飲片有限公司)。水為蒸餾水;所用試劑均為分析純。

        2 方法與結果

        2.1 多糖得率的測定

        2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品33.6 mg,置于100 mL棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液1 mL,加無水乙醇5 mL,搖勻,離心30 min(轉速3 500 r/min),沉淀加水溶解,置于50 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.1.3 標準曲線的建立 精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,加蒸餾水至2 mL,搖勻,在冰浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度,混勻,放冷后置沸水中水浴10 min,取出,立即置冰水浴中冷卻至室溫,取出,以相應試劑為空白,按照紫外可見分光光度法,在502 nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸,得回歸方程Y=0.044 2X+0.055 6(R2=0.999 4),表明無水葡萄糖在3.36~20.16 μg/mL范圍內線性關系良好。

        2.1.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液0.5 mL,置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項下方法測定其吸光度,連續(xù)測定6次。結果,RSD為0.22%,表明儀器精密度良好。

        2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液0.5 mL,置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項下方法,在室溫下每隔15 min測定1次光密度,從0 h開始,連續(xù)測定6次。結果,RSD為0.95%,表明供試品溶液在1.5 h內穩(wěn)定性良好。

        2.1.6 重復性試驗 精密量取6份同批供試品溶液,每份0.5 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項下方法分別測定其吸光度。結果,RSD為1.67%,表明重復性良好。

        2.1.7 加樣回收率 精密量取6份含有量已知的同批供試品溶液,每份0.5 mL,分別精密加入質量濃度為66.73 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.5 mL,混勻按“2.1.3”項下方法分別測定其光密度。結果,平均回收率為107.2%,RSD為1.93%。

        2.1.8 總多糖得率的測定 精密量取供試品溶液0.5 mL,置于10 m L具塞試管中,按“2.1.3“項下方法測定光密度,計算多糖得率。

        2.2 浸膏得率的測定 精密量取水提液25 mL,置于恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105℃下干燥3 h,轉移至干燥器中,冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計算浸膏得率。

        2.3 綜合評分的計算 采用加權平分法,按多糖得率與浸膏得率的權重比(8∶2)計算綜合評分,綜合評分=[(多糖得率/最大多糖得率)×0.8 +(浸膏得率/最大浸膏得率)×0.2]×100。

        2.4 單因素試驗

        2.4.1 浸泡時間考察 取黃精、白及各25 g,共5份,加入10倍量水,分別浸泡0、0.5、1、1.5、2 h,回流提取2 h,提取1次,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結果見圖1。

        圖1 浸泡時間的考察

        2.4.2 加水量考察 取黃精、白及各25 g,共5份,浸泡時間均為1 h,提取2次,加水量分別為6(4,2)、10 (6,4)、14(8,6)、18(10,8)、22(12,10)倍,提取時間為3.5(2,1.5)h,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結果見圖2。

        圖2 加水量的考察

        2.4.3 提取時間考察 取黃精、白及各25 g,共5份,加水浸泡1 h,提取2次,加水量為14(8,6)倍,提取時間分別為1.5(1,0.5)、2.5(1.5,1)、3.5(2,1.5)、4.5(2.5,2)、5.5(3,2.5)h,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結果見圖3。

        圖3 提取時間的考察

        2.5 星點設計-效應面法優(yōu)選

        2.5.1 試驗設計[4-6]在單因素試驗基礎上,以浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素,每個因素設計五個水平進行星點設計試驗,以綜合評分為指標進行工藝優(yōu)選。因素水平見表1,試驗安排及結果見表2。

        表1 精白霧化吸入液提取工藝星點設計-效應面法因素水平表

        表2 精白霧化吸入液提取工藝星點設計-效應面法設計及結果

        2.5.2 模型擬合 運用Design-Expert 7.0軟件,以綜合評分為因變量(Y)對各因素進行多元回歸和二項式擬合,所得多元線性方程為Y=74.79 +4.40A+2.52B+12.02C (P<0.05,R2=0.792 6);多元二項式擬合方程為Y= 78.19 +4.40A+2.52B+12.02C-1.02AB+4.81AC-0.36BC-3.97A2+0.13B2-1.06C2(P<0.01,R2= 0.943 9)。由兩種模型的R2可知,多元二項式模型擬合的效果優(yōu)于多元線性回歸模型,方差分析見表3。

        表3 效應面二次模型方差分析

        由表3可知,各因素對提取工藝影響的大小順序為C>A>B。其中,C(提取時間)和A(浸泡時間)的二次項A2影響極顯著(P<0.01),交互因素AC影響顯著,而因素B、交互因素AB與BC、二次項B2與C2均無顯著性影響。

        2.5.3 工藝優(yōu)選與預測 Design-Expert 7.0軟件處理,各因素對提取工藝的影響見圖4~6。由圖可知,綜合評分較高的提取工藝區(qū)間A為0.42~1.58 h,B為9.38~18.62倍,C為2.35~4.65 h,然后在以上區(qū)間內的效應值中選擇極大值,所得最佳提取工藝參數(shù)為浸泡時間1.58 h,加水量18.62倍,提取時間4.65 h。根據(jù)二次回歸模型方程所得理論值,得到多糖得率11.95%,浸膏得率38.20%,綜合評分95.57。

        考慮到生產實際和操作,將上述優(yōu)選工藝條件修正為加水浸泡1.5 h,回流提取2次,加水量分別為10、8倍,提取時間分別為2.5、2 h。

        2.5.4 驗證試驗 根據(jù)以上優(yōu)選的工藝條件,取黃精、白及各25 g,共3份,進行最優(yōu)工藝驗證試驗,并對試驗結果取平均值,然后與擬合方程的預測值進行比較。結果,實測值與預測值相近,表明上述預測模型擬合度良好,見表4。

        表4 3批樣品最佳工藝驗證試驗

        圖4 浸泡時間與加水量對提取的影響

        圖5 浸泡時間與提取時間對提取的影響

        圖6 加水量與提取時間對提取的影響

        2.6 提取次數(shù)的考察 在上述星點驗證試驗提取2次的基礎上,取藥渣加8倍量水,進行第3次提取,提取時間為2.0 h,將藥液定容至500 mL,分別測定總多糖含有量和浸膏得率,并計算綜合評分。結果表明,第3次提取液中各指標值占3次提取液各指標值總和的百分比均<10%。因此,從降低生產成本角度考慮,確定以提取2次為宜。

        3 討論

        方中黃精、白及均含有大量多糖,具有免疫增強作用[7],能加快肺結核的痊愈過程。同時,當多糖濃度達到15~20 mg/mL時,抑菌效果甚至優(yōu)于50 ppm的鏈霉素[8-9],故本實驗以多糖得率為評價指標具有一定合理性。

        星點設計是國外常用的實驗設計方法,近年來國內也有將其用于優(yōu)化處方或成型工藝的報道[10-14]。本實驗在進行星點設計之前,對擬考察的因素進行了單因素試驗,其結果可為星點設計中各因素水平中心點與極值點(試驗范圍)的確定提供實驗依據(jù),避免因盲目選擇試驗點造成試驗區(qū)域遠離較優(yōu)區(qū),導致試驗設計不能達到優(yōu)化工藝條件的目的,同時也避免了因試驗失敗造成的各種損失。在星點設計中,各因素的中心點一般可結合專業(yè)知識,選擇單因素試驗中效應值最大的點(水平)或其相近的點,這將有助于提高試驗模型預測的準確度。

        星點設計是一種新型的試驗設計方法,在藥學應用上成效顯著。與國內運用廣泛的均勻設計和正交設計相比,它是通過非線性模型擬合來得出最佳條件,具有試驗精度高、預測性好等特點[15]。本實驗進行了6次中心點重復試驗,較好地保證了精度,同時根據(jù)二次回歸模型方程,得到的理論值分別為多糖得率11.95%,浸膏得率38.20%,綜合評分95.57。然后按照模型優(yōu)選出的最佳工藝進行了驗證試驗,將結果與理論值比較,發(fā)現(xiàn)偏差為3.42%,說明該模型預測性良好。

        另外,通過方差分析和三維效應面圖,可以直觀看出各因素間的交互作用以及其影響藥材浸出效果的規(guī)律,有助于選擇試驗的最優(yōu)方案。

        參考文獻:

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        *通信作者:夏新華(1962—),男,博士,教授,博士生導師,從事中藥新制劑、新劑型、新技術及制劑質量標準的研究。Te1:(0731)88458305,E-mai1:xiaxinhua001@163.com

        作者簡介:杜 陽(1987—),女,碩士生,從事中藥新制劑及制劑質量標準的研究。Te1:18975895818,E-mai1:328540252@qq.com

        基金項目:國家科技重大專項(2013ZX10005004 -003 -001)

        收稿日期:2014-09-23

        doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.044

        中圖分類號:R284.2

        文獻標志碼:B

        文章編號:1001-1528(2016)01-0184-04

        網絡出版日期:2015-03-18

        網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150318.0952.001.htm1

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