杜 陽， 夏新華*， 賀蘭芝， 曾建國， 劉艷科

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙410004）

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星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝

杜 陽1， 夏新華1*， 賀蘭芝1， 曾建國2， 劉艷科2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙410004）

摘要：目的 用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選精白霧化吸入液的最佳提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為自變量，以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，用效應(yīng)面法選擇最佳提取工藝。結(jié)果 確定精白霧化吸入液的最佳提取工藝為加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分別為10、8倍，提取時(shí)間分別為2.5、2.0 h。結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選出的提取工藝簡單、穩(wěn)定，預(yù)測性良好，可為精白霧化吸入液的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：精白霧化吸入液；多糖；浸膏；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；提取工藝

精白霧化吸入液由黃精、白及兩味中藥組成，具有益肺、殺蟲、化瘀新生之功效，臨床以霧化吸入方式給藥，對治療肺結(jié)核具有一定療效。方中黃精、白及所含多糖為本制劑的主要活性成分，其藥理作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道［1 -3］，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。為提高本制劑的質(zhì)量，確保臨床治療效果，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)多糖的性質(zhì)，采用水煎煮法進(jìn)行提取，并以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為指標(biāo)，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DK-98 -Ⅱ型水浴鍋、98 -1 -B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰勒特儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6020AB型真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；YD601N型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201205）。黃精、白及（湖南三湘中藥飲片有限公司）。水為蒸餾水；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖得率的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品33.6 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液1 mL，加無水乙醇5 mL，搖勻，離心30 min（轉(zhuǎn)速3 500 r/min），沉淀加水溶解，置于50 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至2 mL，搖勻，在冰浴中緩慢滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置沸水中水浴10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻至室溫，取出，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外可見分光光度法，在502 nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.044 2X+0.055 6（R2=0.999 4），表明無水葡萄糖在3.36～20.16 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密量取對照品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定其吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果，RSD為0.22％，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，在室溫下每隔15 min測定1次光密度，從0 h開始，連續(xù)測定6次。結(jié)果，RSD為0.95％，表明供試品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取6份同批供試品溶液，每份0.5 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測定其吸光度。結(jié)果，RSD為1.67％，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 精密量取6份含有量已知的同批供試品溶液，每份0.5 mL，分別精密加入質(zhì)量濃度為66.73 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.5 mL，混勻按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測定其光密度。結(jié)果，平均回收率為107.2％，RSD為1.93％。

2.1.8 總多糖得率的測定 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 m L具塞試管中，按“2.1.3“項(xiàng)下方法測定光密度，計(jì)算多糖得率。

2.2 浸膏得率的測定 精密量取水提液25 mL，置于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下干燥3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算浸膏得率。

2.3 綜合評分的計(jì)算 采用加權(quán)平分法，按多糖得率與浸膏得率的權(quán)重比（8∶2）計(jì)算綜合評分，綜合評分=［（多糖得率/最大多糖得率）×0.8 +（浸膏得率/最大浸膏得率）×0.2］×100。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 浸泡時(shí)間考察 取黃精、白及各25 g，共5份，加入10倍量水，分別浸泡0、0.5、1、1.5、2 h，回流提取2 h，提取1次，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結(jié)果見圖1。

圖1　浸泡時(shí)間的考察

2.4.2 加水量考察 取黃精、白及各25 g，共5份，浸泡時(shí)間均為1 h，提取2次，加水量分別為6（4，2）、10 （6，4）、14（8，6）、18（10，8）、22（12，10）倍，提取時(shí)間為3.5（2，1.5）h，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結(jié)果見圖2。

圖2　加水量的考察

2.4.3 提取時(shí)間考察 取黃精、白及各25 g，共5份，加水浸泡1 h，提取2次，加水量為14（8，6）倍，提取時(shí)間分別為1.5（1，0.5）、2.5（1.5，1）、3.5（2，1.5）、4.5（2.5，2）、5.5（3，2.5）h，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結(jié)果見圖3。

圖3　提取時(shí)間的考察

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)［4-6］在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)五個(gè)水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以綜合評分為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選。因素水平見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1　精白霧化吸入液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法因素水平表

表2　精白霧化吸入液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.2 模型擬合 運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件，以綜合評分為因變量（Y）對各因素進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式擬合，所得多元線性方程為Y=74.79 +4.40A+2.52B+12.02C （P＜0.05，R2=0.792 6）；多元二項(xiàng)式擬合方程為Y= 78.19 +4.40A+2.52B+12.02C-1.02AB+4.81AC-0.36BC-3.97A2+0.13B2-1.06C2（P＜0.01，R2= 0.943 9）。由兩種模型的R2可知，多元二項(xiàng)式模型擬合的效果優(yōu)于多元線性回歸模型，方差分析見表3。

表3　效應(yīng)面二次模型方差分析

由表3可知，各因素對提取工藝影響的大小順序?yàn)镃＞A＞B。其中，C（提取時(shí)間）和A（浸泡時(shí)間）的二次項(xiàng)A2影響極顯著（P＜0.01），交互因素AC影響顯著，而因素B、交互因素AB與BC、二次項(xiàng)B2與C2均無顯著性影響。

2.5.3 工藝優(yōu)選與預(yù)測 Design-Expert 7.0軟件處理，各因素對提取工藝的影響見圖4～6。由圖可知，綜合評分較高的提取工藝區(qū)間A為0.42～1.58 h，B為9.38～18.62倍，C為2.35～4.65 h，然后在以上區(qū)間內(nèi)的效應(yīng)值中選擇極大值，所得最佳提取工藝參數(shù)為浸泡時(shí)間1.58 h，加水量18.62倍，提取時(shí)間4.65 h。根據(jù)二次回歸模型方程所得理論值，得到多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，綜合評分95.57。

考慮到生產(chǎn)實(shí)際和操作，將上述優(yōu)選工藝條件修正為加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分別為10、8倍，提取時(shí)間分別為2.5、2 h。

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)以上優(yōu)選的工藝條件，取黃精、白及各25 g，共3份，進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，并對試驗(yàn)結(jié)果取平均值，然后與擬合方程的預(yù)測值進(jìn)行比較。結(jié)果，實(shí)測值與預(yù)測值相近，表明上述預(yù)測模型擬合度良好，見表4。

表4　3批樣品最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

圖4　浸泡時(shí)間與加水量對提取的影響

圖5　浸泡時(shí)間與提取時(shí)間對提取的影響

圖6　加水量與提取時(shí)間對提取的影響

2.6 提取次數(shù)的考察 在上述星點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)提取2次的基礎(chǔ)上，取藥渣加8倍量水，進(jìn)行第3次提取，提取時(shí)間為2.0 h，將藥液定容至500 mL，分別測定總多糖含有量和浸膏得率，并計(jì)算綜合評分。結(jié)果表明，第3次提取液中各指標(biāo)值占3次提取液各指標(biāo)值總和的百分比均＜10％。因此，從降低生產(chǎn)成本角度考慮，確定以提取2次為宜。

3 討論

方中黃精、白及均含有大量多糖，具有免疫增強(qiáng)作用［7］，能加快肺結(jié)核的痊愈過程。同時(shí)，當(dāng)多糖濃度達(dá)到15～20 mg/mL時(shí)，抑菌效果甚至優(yōu)于50 ppm的鏈霉素［8-9］，故本實(shí)驗(yàn)以多糖得率為評價(jià)指標(biāo)具有一定合理性。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國外常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，近年來國內(nèi)也有將其用于優(yōu)化處方或成型工藝的報(bào)道［10-14］。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)之前，對擬考察的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，其結(jié)果可為星點(diǎn)設(shè)計(jì)中各因素水平中心點(diǎn)與極值點(diǎn)（試驗(yàn)范圍）的確定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，避免因盲目選擇試驗(yàn)點(diǎn)造成試驗(yàn)區(qū)域遠(yuǎn)離較優(yōu)區(qū)，導(dǎo)致試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能達(dá)到優(yōu)化工藝條件的目的，同時(shí)也避免了因試驗(yàn)失敗造成的各種損失。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中，各因素的中心點(diǎn)一般可結(jié)合專業(yè)知識，選擇單因素試驗(yàn)中效應(yīng)值最大的點(diǎn)（水平）或其相近的點(diǎn)，這將有助于提高試驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確度。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是一種新型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在藥學(xué)應(yīng)用上成效顯著。與國內(nèi)運(yùn)用廣泛的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)相比，它是通過非線性模型擬合來得出最佳條件，具有試驗(yàn)精度高、預(yù)測性好等特點(diǎn)［15］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了6次中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，較好地保證了精度，同時(shí)根據(jù)二次回歸模型方程，得到的理論值分別為多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，綜合評分95.57。然后按照模型優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，將結(jié)果與理論值比較，發(fā)現(xiàn)偏差為3.42％，說明該模型預(yù)測性良好。

另外，通過方差分析和三維效應(yīng)面圖，可以直觀看出各因素間的交互作用以及其影響藥材浸出效果的規(guī)律，有助于選擇試驗(yàn)的最優(yōu)方案。

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*通信作者：夏新華（1962—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。Te1：（0731）88458305，E-mai1：xiaxinhua001@163.com

作者簡介：杜 陽（1987—），女，碩士生，從事中藥新制劑及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。Te1：18975895818，E-mai1：328540252@qq.com

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX10005004 -003 -001）

收稿日期：2014-09-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.044

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0184-04

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-03-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150318.0952.001.htm1