杜 陽, 夏新華*, 賀蘭芝, 曾建國, 劉艷科
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南長沙410208;2.長沙市中心醫(yī)院,湖南長沙410004)
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星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝
杜 陽1, 夏新華1*, 賀蘭芝1, 曾建國2, 劉艷科2
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南長沙410208;2.長沙市中心醫(yī)院,湖南長沙410004)
摘要:目的 用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選精白霧化吸入液的最佳提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為自變量,以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo),用效應(yīng)面法選擇最佳提取工藝。結(jié)果 確定精白霧化吸入液的最佳提取工藝為加水浸泡1.5 h,回流提取2次,加水量分別為10、8倍,提取時(shí)間分別為2.5、2.0 h。結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選出的提取工藝簡單、穩(wěn)定,預(yù)測性良好,可為精白霧化吸入液的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
關(guān)鍵詞:精白霧化吸入液;多糖;浸膏;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法;提取工藝
精白霧化吸入液由黃精、白及兩味中藥組成,具有益肺、殺蟲、化瘀新生之功效,臨床以霧化吸入方式給藥,對治療肺結(jié)核具有一定療效。方中黃精、白及所含多糖為本制劑的主要活性成分,其藥理作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[1 -3],具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。為提高本制劑的質(zhì)量,確保臨床治療效果,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)多糖的性質(zhì),采用水煎煮法進(jìn)行提取,并以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為指標(biāo),用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。
1.1 儀器與設(shè)備 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);DK-98 -Ⅱ型水浴鍋、98 -1 -B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰勒特儀器有限公司);SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6020AB型真空干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);YD601N型電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。
1.2 試藥 無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110833-201205)。黃精、白及(湖南三湘中藥飲片有限公司)。水為蒸餾水;所用試劑均為分析純。
2.1 多糖得率的測定
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品33.6 mg,置于100 mL棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液1 mL,加無水乙醇5 mL,搖勻,離心30 min(轉(zhuǎn)速3 500 r/min),沉淀加水溶解,置于50 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,加蒸餾水至2 mL,搖勻,在冰浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度,混勻,放冷后置沸水中水浴10 min,取出,立即置冰水浴中冷卻至室溫,取出,以相應(yīng)試劑為空白,按照紫外可見分光光度法,在502 nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=0.044 2X+0.055 6(R2=0.999 4),表明無水葡萄糖在3.36~20.16 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密量取對照品溶液0.5 mL,置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定其吸光度,連續(xù)測定6次。結(jié)果,RSD為0.22%,表明儀器精密度良好。
2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.5 mL,置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法,在室溫下每隔15 min測定1次光密度,從0 h開始,連續(xù)測定6次。結(jié)果,RSD為0.95%,表明供試品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取6份同批供試品溶液,每份0.5 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測定其吸光度。結(jié)果,RSD為1.67%,表明重復(fù)性良好。
2.1.7 加樣回收率 精密量取6份含有量已知的同批供試品溶液,每份0.5 mL,分別精密加入質(zhì)量濃度為66.73 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.5 mL,混勻按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測定其光密度。結(jié)果,平均回收率為107.2%,RSD為1.93%。
2.1.8 總多糖得率的測定 精密量取供試品溶液0.5 mL,置于10 m L具塞試管中,按“2.1.3“項(xiàng)下方法測定光密度,計(jì)算多糖得率。
2.2 浸膏得率的測定 精密量取水提液25 mL,置于恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105℃下干燥3 h,轉(zhuǎn)移至干燥器中,冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計(jì)算浸膏得率。
2.3 綜合評分的計(jì)算 采用加權(quán)平分法,按多糖得率與浸膏得率的權(quán)重比(8∶2)計(jì)算綜合評分,綜合評分=[(多糖得率/最大多糖得率)×0.8 +(浸膏得率/最大浸膏得率)×0.2]×100。
2.4 單因素試驗(yàn)
2.4.1 浸泡時(shí)間考察 取黃精、白及各25 g,共5份,加入10倍量水,分別浸泡0、0.5、1、1.5、2 h,回流提取2 h,提取1次,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結(jié)果見圖1。
圖1 浸泡時(shí)間的考察
2.4.2 加水量考察 取黃精、白及各25 g,共5份,浸泡時(shí)間均為1 h,提取2次,加水量分別為6(4,2)、10 (6,4)、14(8,6)、18(10,8)、22(12,10)倍,提取時(shí)間為3.5(2,1.5)h,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結(jié)果見圖2。
圖2 加水量的考察
2.4.3 提取時(shí)間考察 取黃精、白及各25 g,共5份,加水浸泡1 h,提取2次,加水量為14(8,6)倍,提取時(shí)間分別為1.5(1,0.5)、2.5(1.5,1)、3.5(2,1.5)、4.5(2.5,2)、5.5(3,2.5)h,收集提取液,按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率,結(jié)果見圖3。
圖3 提取時(shí)間的考察
2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選
2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4-6]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為考察因素,每個(gè)因素設(shè)計(jì)五個(gè)水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn),以綜合評分為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選。因素水平見表1,試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。
表1 精白霧化吸入液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法因素水平表
表2 精白霧化吸入液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果
2.5.2 模型擬合 運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件,以綜合評分為因變量(Y)對各因素進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式擬合,所得多元線性方程為Y=74.79 +4.40A+2.52B+12.02C (P<0.05,R2=0.792 6);多元二項(xiàng)式擬合方程為Y= 78.19 +4.40A+2.52B+12.02C-1.02AB+4.81AC-0.36BC-3.97A2+0.13B2-1.06C2(P<0.01,R2= 0.943 9)。由兩種模型的R2可知,多元二項(xiàng)式模型擬合的效果優(yōu)于多元線性回歸模型,方差分析見表3。
表3 效應(yīng)面二次模型方差分析
由表3可知,各因素對提取工藝影響的大小順序?yàn)镃>A>B。其中,C(提取時(shí)間)和A(浸泡時(shí)間)的二次項(xiàng)A2影響極顯著(P<0.01),交互因素AC影響顯著,而因素B、交互因素AB與BC、二次項(xiàng)B2與C2均無顯著性影響。
2.5.3 工藝優(yōu)選與預(yù)測 Design-Expert 7.0軟件處理,各因素對提取工藝的影響見圖4~6。由圖可知,綜合評分較高的提取工藝區(qū)間A為0.42~1.58 h,B為9.38~18.62倍,C為2.35~4.65 h,然后在以上區(qū)間內(nèi)的效應(yīng)值中選擇極大值,所得最佳提取工藝參數(shù)為浸泡時(shí)間1.58 h,加水量18.62倍,提取時(shí)間4.65 h。根據(jù)二次回歸模型方程所得理論值,得到多糖得率11.95%,浸膏得率38.20%,綜合評分95.57。
考慮到生產(chǎn)實(shí)際和操作,將上述優(yōu)選工藝條件修正為加水浸泡1.5 h,回流提取2次,加水量分別為10、8倍,提取時(shí)間分別為2.5、2 h。
2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)以上優(yōu)選的工藝條件,取黃精、白及各25 g,共3份,進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn),并對試驗(yàn)結(jié)果取平均值,然后與擬合方程的預(yù)測值進(jìn)行比較。結(jié)果,實(shí)測值與預(yù)測值相近,表明上述預(yù)測模型擬合度良好,見表4。
表4 3批樣品最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)
圖4 浸泡時(shí)間與加水量對提取的影響
圖5 浸泡時(shí)間與提取時(shí)間對提取的影響
圖6 加水量與提取時(shí)間對提取的影響
2.6 提取次數(shù)的考察 在上述星點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)提取2次的基礎(chǔ)上,取藥渣加8倍量水,進(jìn)行第3次提取,提取時(shí)間為2.0 h,將藥液定容至500 mL,分別測定總多糖含有量和浸膏得率,并計(jì)算綜合評分。結(jié)果表明,第3次提取液中各指標(biāo)值占3次提取液各指標(biāo)值總和的百分比均<10%。因此,從降低生產(chǎn)成本角度考慮,確定以提取2次為宜。
方中黃精、白及均含有大量多糖,具有免疫增強(qiáng)作用[7],能加快肺結(jié)核的痊愈過程。同時(shí),當(dāng)多糖濃度達(dá)到15~20 mg/mL時(shí),抑菌效果甚至優(yōu)于50 ppm的鏈霉素[8-9],故本實(shí)驗(yàn)以多糖得率為評價(jià)指標(biāo)具有一定合理性。
星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國外常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,近年來國內(nèi)也有將其用于優(yōu)化處方或成型工藝的報(bào)道[10-14]。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)之前,對擬考察的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn),其結(jié)果可為星點(diǎn)設(shè)計(jì)中各因素水平中心點(diǎn)與極值點(diǎn)(試驗(yàn)范圍)的確定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),避免因盲目選擇試驗(yàn)點(diǎn)造成試驗(yàn)區(qū)域遠(yuǎn)離較優(yōu)區(qū),導(dǎo)致試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能達(dá)到優(yōu)化工藝條件的目的,同時(shí)也避免了因試驗(yàn)失敗造成的各種損失。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中,各因素的中心點(diǎn)一般可結(jié)合專業(yè)知識,選擇單因素試驗(yàn)中效應(yīng)值最大的點(diǎn)(水平)或其相近的點(diǎn),這將有助于提高試驗(yàn)?zāi)P皖A(yù)測的準(zhǔn)確度。
星點(diǎn)設(shè)計(jì)是一種新型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,在藥學(xué)應(yīng)用上成效顯著。與國內(nèi)運(yùn)用廣泛的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)相比,它是通過非線性模型擬合來得出最佳條件,具有試驗(yàn)精度高、預(yù)測性好等特點(diǎn)[15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了6次中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn),較好地保證了精度,同時(shí)根據(jù)二次回歸模型方程,得到的理論值分別為多糖得率11.95%,浸膏得率38.20%,綜合評分95.57。然后按照模型優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn),將結(jié)果與理論值比較,發(fā)現(xiàn)偏差為3.42%,說明該模型預(yù)測性良好。
另外,通過方差分析和三維效應(yīng)面圖,可以直觀看出各因素間的交互作用以及其影響藥材浸出效果的規(guī)律,有助于選擇試驗(yàn)的最優(yōu)方案。
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*通信作者:夏新華(1962—),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,從事中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。Te1:(0731)88458305,E-mai1:xiaxinhua001@163.com
作者簡介:杜 陽(1987—),女,碩士生,從事中藥新制劑及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。Te1:18975895818,E-mai1:328540252@qq.com
基金項(xiàng)目:國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10005004 -003 -001)
收稿日期:2014-09-23
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.044
中圖分類號:R284.2
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B
文章編號:1001-1528(2016)01-0184-04
網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-03-18
網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150318.0952.001.htm1