張群群， 李慧芬，2， 張學(xué)蘭，2*， 吳 鵬， 王均秀， 宋夢晗， 趙 鑫

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟南250355）

?

HPLC-ELSD法同時測定不同產(chǎn)地白果藥材中4種萜內(nèi)酯類成分

張群群1， 李慧芬1，2， 張學(xué)蘭1，2*， 吳 鵬1， 王均秀1， 宋夢晗1， 趙 鑫1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟南250355）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法同時測定白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C。方法 白果乙酸乙酯萃取物的分析采用Kromasi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃，體積流量0.8 mL/min。結(jié)果 白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C分別在1.01～40.40 μg、1.03～41.20 μg、2.37～94.80 μg、1.51～60.40 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999 5），平均回收率在97.3％～99.2％之間。5個不同產(chǎn)地（山東濟南、臨沂、泰安，廣西桂林和江蘇泰興）白果藥材中四者的含有量分別為75.55～219.73、54.79～135.88、200.37～853.39、119.31～498.06 μg/g。結(jié)論 白果中4種萜內(nèi)酯類成分的總含有量以江蘇省泰興市產(chǎn)者為最高。

關(guān)鍵詞：白果；白果內(nèi)酯；銀杏內(nèi)酯A；銀杏內(nèi)酯B；銀杏內(nèi)酯C；產(chǎn)地；HPLC-ELSD

白果為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子，其味甘、苦、澀，性平，有毒，具有斂肺定喘、止帶縮尿的功能［1］，含有銀杏酸、萜內(nèi)酯、黃酮等成分［2-3］，其中萜內(nèi)酯類化合物有銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯等［4-5］。研究表明，銀杏酚酸類成分具有致敏性、細(xì)胞毒性和免疫毒性，為白果的主要毒性成分［6］；白果萜內(nèi)酯是血小板活化因子的拮抗劑，對心腦血管疾病具有獨特的藥理作用，廣泛用于治療和預(yù)防心腦血管疾?。?］；白果內(nèi)酯具有提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和抗卡氏肺孢子蟲肺炎作用［8-9］。關(guān)于白果藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》2010年版一部僅收載了成品的外觀性狀、粉末的顯微特征及薄層色譜的定性鑒別，缺乏有效成分或指標(biāo)成分的含有量測定指標(biāo)和參數(shù)，難以控制白果藥材的質(zhì)量。李轉(zhuǎn)梅等［10］建立了白果藥材及炮制品中白果酸和總銀杏酸含有量的測定方法，羅曼等［11］建立了白果仁萜內(nèi)酯類成分的HPLC-ELSD指紋圖譜定性分析方法，但未見對白果中萜類內(nèi)酯成分定量測定的相關(guān)報道。目前，銀杏葉及其制劑中該類成分的定量測定方法有HPLC-ELSD、HPLCMS/MS、UPLC-TQ-MS等［12-14］。本實驗建立了HPLC-ELSD同時測定白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的方法，并測定了5個不同產(chǎn)地、批次白果藥材中這些成分的含有量，可為其質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型HPLC色譜儀、e2424型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Waters公司）；FA1604N型電子天平（十萬分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含有量測定用，批號分別為110865-200605、110862-200608、110863-200508、110864-200906）。HPLC用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

白果藥材的產(chǎn)地分別為山東省濟南市長清區(qū)、臨沂市、泰安市、廣西省桂林市、江蘇省泰興市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的成熟種子。除去雜質(zhì)，50℃下烘干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取白果內(nèi)酯5.05 mg、銀杏內(nèi)酯A 5.15 mg、銀杏內(nèi)酯B 4.74 mg、銀杏內(nèi)酯C 3.02 mg，置于1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。分別吸取四種對照品溶液0.2、0.2、0.5、0.5 mL，置于同一2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含白果內(nèi)酯0.505 mg、銀杏內(nèi)酯A 0.515 mg、銀杏內(nèi)酯B 1.185 mg、銀杏內(nèi)酯C 0.755 mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取各樣品粉末（過3號篩）5 g，分別置于索氏提取器中，加甲醇80 mL，水浴回流提取6 h至無色，減壓回收甲醇蒸干，殘渣加水20 mL，70℃水浴溫?zé)崾蛊淙芙?。再往里?％稀鹽酸溶液2滴，乙酸乙酯萃取3次（15、10、10 mL），合并提取液，5％乙酸鈉溶液20 mL洗滌，洗液再用乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗液，純水洗滌2次，每次20 mL，合并水洗液，10 mL乙酸乙酯洗滌，合并乙酸乙酯液，回收至干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃；體積流量0.8 mL/min；蒸發(fā)光檢測器的漂移管溫度60℃；載氣流量25 L/min。在上述條件下，白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C與其他成分均可達到基線分離，見圖1。

1.白果內(nèi)酯 2.銀杏內(nèi)酯C 3.銀杏內(nèi)酯A 4.銀杏內(nèi)酯B1.bi1oba1ide 2.ginkgo1ide C 3.ginkgo1ide A 4.ginkgo1ide B圖1　混合對照品與白果藥材的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed reference substances and Ginkgo Semen sam ples

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液2、10、20、40、80 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.3”項色譜條件下進行測定，記錄色譜峰峰面積，以進樣量（μg）對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，計算回歸方程。結(jié)果，各成分線性關(guān)系良好，見表1。

表1　4種內(nèi)酯類成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of four terpene lactones

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（山東省濟南市長清區(qū)）10 μL，注入HPLC色譜儀，連續(xù)進樣6次，測定白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積。結(jié)果，RSD分別為1.5％、1.5％、1.5％和1.8％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（山東省濟南市長清區(qū)）適量，室溫下分別在0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積。結(jié)果，RSD分別為1.6％、1.3％、1.9％、1.8％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一產(chǎn)地白果藥材粉末（山東省濟南市長清區(qū)，過3號篩）6份，每份5 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項色譜條件下測定，計算白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的含有量。結(jié)果，四種成分的平均含有量分別為80、57、204、141 μg/g，RSD分別為1.1％、1.9％、1.9％、2.5％，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的白果藥材（山東省濟南市長清區(qū)，過3號篩）6份，每份2.5 g，精密加入白果內(nèi)酯（0.019 51 g/L）、銀杏內(nèi)酯A（0.013 26 g/L）、銀杏內(nèi)酯B （0.050 92 g/L）、銀杏內(nèi)酯C（0.034 51 g/L）對照品溶液1 mL，甲醇補足至80 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項色譜條件下測定，結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定 精密吸取混合對照品和供試品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀進行分析測定，計算樣品中4種內(nèi)酯類成分的含有量，結(jié)果見表3。

3 小結(jié)與討論

白果萜內(nèi)酯類成分在紫外末端有吸收，HPLCUV測定時靈敏度低，雜質(zhì)干擾大，重復(fù)性差。本實驗首次建立了HPLC-ELSD法同時定量測定不同產(chǎn)地白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的含有量，對提取溶劑50％、70％、100％甲醇進行比較，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑提取的4種萜內(nèi)酯成分總含有量最高；對甲醇索式回流6 h和甲醇超聲1 h進行比較，發(fā)現(xiàn)前者提取效果較好，而且色譜峰峰形理想，同時還對流動相等參數(shù)進行了考察。綜上所述，該方法簡便、可靠、有效，可用于白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C成分的測定，為其質(zhì)量控制提供一定參考。

不同產(chǎn)地、批次白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C成分的含有量相差較大，四者總含有量最高者是最低者的4倍。因此，建議將這4種成分的含有量限度納入白果藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以期更全面地控制其質(zhì)量。

由于白果中內(nèi)酯類成分的含有量較低，測定時取樣量大，而且甲醇提取液中含有較多色素等雜質(zhì)，干擾測定，對儀器損害嚴(yán)重，故需作進一步純化。本實驗采用乙酸乙酯萃取法，將四種萜內(nèi)酯類成分充分轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯中，可排除色譜測定時雜質(zhì)的干擾，而且它們與其他成分分離度良好。

表2　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Resu lts of recovery tests（n=6）

表3　4種萜內(nèi)酯成分含有量的測定結(jié)果（μg/g，n=2）Tab.3 Determ ination results of the contents of four terpene lactones（μg/g，n=2）

參考文獻：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：100.

［2］ 傅豐永，于德泉，宋維良，等.白果化學(xué)成分的研究［J］.化學(xué)學(xué)報，1992，28（1）：52-56.

［3］ 王 琴，溫其標(biāo).銀杏種仁中活性成分及其藥理作用的研究進展［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22（1）：164-167.

［4］ 周桂生，姚 鑫，唐于平，等.白果仁化學(xué)成分研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，47（17）：1362-1366.

［5］ 周桂生，姚 鑫，唐于平，等.銀杏中種皮化學(xué)成分的分離及鑒定［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報，2013，22（4）：108-110.

［6］ 楊劍婷，吳彩娥.白果致過敏成分及其致敏機理研究進展［J］.食品科技，2009，34（6）：282-286.

［7］ 葉 敏，果德安.銀杏萜內(nèi)酯的研究概況［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5（1）：33-38.

［8］ 黃 歡，曹明成，朱正義，等.白果內(nèi)酯對血管性癡呆小鼠的保護作用［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（3）：383-386.

［9］ 唐小葵，倪小毅，陳雅棠，等.白果內(nèi)酯抗大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎的實驗研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，25 （10）：851-853.

［10］ 李轉(zhuǎn)梅，張學(xué)蘭，李慧芬，等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較［J］.中成藥，2015，37 （1）：164-168.

［11］ 羅 曼，鮑家科，熊慧林，等.白果仁萜類內(nèi)酯成分的指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33（9）：1465-1469.

［12］ 鞏麗麗，田景振.HPLC-ELSD法測定銀杏葉提取物中萜內(nèi)酯含量［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，37（1）：69-70.

［13］ 沈 濤，高彥慧，婁紅祥.LC-MS/MS快速測定不同采摘時間銀杏葉中銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43（5）：380-383.

［14］ 姚 鑫，周桂生，唐于平，等.基于UPLC-TQ-MS考察不同樹齡果用銀杏葉萜內(nèi)酯含量變化規(guī)律［J］.中國中藥雜志，2013，38（3）：376-380.

Simultaneous determ ination of four terpene lactones in Ginkgo Semen from dif-

ferent grow ing areas by HPLC-ELSD

ZHANG Qun-qun1， LI Hui-fen1，2， ZHANG Xue-1an1，2*， WU Peng1， WANG Jun-xiu1， SONG Meng-han1， ZHAO Xin1
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China；2.Traditional Chinese Medicine Processing Technology Helitage Base，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish amethod for simu1taneous1y determining the contents of bi1oba1ide and ginkgo1-ide A，B，C in Ginkgo Semen by HPLC-ELSD.METHODS The ana1ysis of Ginkgo Semen ethy1acetate extract was performed on Kromasi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobi1e phasewasmethano1-0.1％ methanoic acid water（38∶62），co1umn temperature wasmaintained at30℃，and f1ow rate was 0.8 mL/min.RESULTS Bi1oba1ide and ginkgo1ide A，B，C had good 1inear re1ationships in the ranges of 1.01 -40.40 μg，1.03 -41.20 μg，2.37 -94.80 μg and 1.51 -60.40 μg，respective1y（r＞0.999 5）.Their average recoveries were 97.3％ -99.2％.The contents of these four consitituents in Ginkgo Semen from five different growing areas（Jinan，Linyi，Taian in Shandong，Gui1in in Guangxi and Taixing in Jiangsu）were 75.55 -219.73 μg/g，54.79 -135.88 μg/g，200.37 -853.39 μg/g and 119.31 -498.06 μg/g，respective1y.CONCLUSION The tota1 contents of four terpene 1actones in Ginkgo Semen is the highest in Taixing（Jiangsu）.

KEY WORDS：Ginkgo Semen；bi1oba1ide；ginkgo1ide A；ginkgo1ide B；ginkgo1ide C；growing areas；HPLC-ELSD

*通信作者：張學(xué)蘭（1963—），女，教授，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Te1：（0531）89628081，E-mai1：zhang8832440@sina.com

作者簡介：張群群（1988—），女，碩士，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Te1：18753151090，E-mai1：zhangqunqun01@163.com

基金項目：濟南市高校自主創(chuàng)新計劃項目（201303027）

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.030

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0133-04