衛(wèi) 國， 邊海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文愛東

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

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福林酚比色法測定優(yōu)泌嘉膠囊中多肽

衛(wèi) 國， 邊海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文愛東*

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

摘要：目的 采用福林酚比色（Lowry）法測定優(yōu)泌嘉膠囊（五谷蟲）中多肽含有量。方法 優(yōu)泌嘉膠囊水提液中加入堿性銅試液和福林酚溶液后，紫外-可見分光光度法在750 nm波長處測定吸光度。結(jié)果 優(yōu)泌嘉膠囊中多肽平均含有量為15.12％，即49.90 mg/粒（以每粒膠囊0.33 g計）。多肽檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為40.4～404 μg/mL（r= 0.999 0），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2％，平均回收率為99.6％（RSD為0.96％，n =9）。結(jié)論 建立的多肽定量測定方法簡單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：優(yōu)泌嘉膠囊；多肽；福林酚比色法

優(yōu)泌嘉膠囊是由五谷蟲（麗蠅科動物大頭金蠅Chrysomyia megacephala）蟲體經(jīng)消毒、速凍、打漿、低溫真空凍干、過篩、裝膠囊等工藝制成的膠囊劑，是第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有滋陰降火、健脾益腎、降脂降糖的功效，臨床主要用于糖尿病及其并發(fā)癥。

五谷蟲化學(xué)成分復(fù)雜，多為高分子有機(jī)化合物，主要成分為不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)及肽類［1］。為有效控制該制劑質(zhì)量，保障藥品的安全性和有效性，本實(shí)驗(yàn)采用福林酚比色（Lowry）法測定膠囊中多肽含有量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV2600紫外分光光度計（日本島津公司）；VP-SOOH超聲清洗器（熊貓集團(tuán)南京電子計量有限公司）；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1.2 試藥 血清白蛋白（牛）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號140619-201421，純度100％）。優(yōu)泌嘉膠囊（自制，批號分別為140729-5、140729-6、140729-7，0.33 g/粒）。福林酚試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20140516，生化純）；氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀、硫酸銅都為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備液 取牛血清白蛋白對照品適量，精密稱定20.20 mg，置于20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對照蛋白溶液 精密量取對照品貯備液2.5 mL至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 取10粒優(yōu)泌嘉膠囊內(nèi)容物混勻，精密稱取約0.1 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲處理（功率240 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，再精密稱定質(zhì)量，水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管，12 000 r/min離心10 min，取上清，即得。

2.2 測定方法 精密量取供試溶液1 mL至試管內(nèi)，加堿性銅溶液5 mL，搖勻，37℃放置10 min，快速加入酚試劑0.5 mL，立即搖勻，37℃下放置30 min，顯色后，冰浴5 min，按照紫外-可見分光光度法（附錄ⅡA），在波長750 nm處測定吸光度。精密量取水1 mL，自“加堿性銅溶液5 mL”起，同法操作，作為空白對照。

2.3 檢測波長的確定 取對照蛋白溶液和供試品溶液，分別在400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)二者的吸收變化一致，均在773.50 nm處有最大吸收。最終確定，以與該波長相近的常用波長750 nm為顯色波長。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對照品貯備液（質(zhì)量濃度為1 010 μg/mL），梯度稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為40.4、80.8、121.2、202、404 μg/mL的蛋白溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法操作。以吸光度（A）對質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行直線回歸，得線性方程為A=0.002C+0.076 6（r= 0.999 0），表明蛋白質(zhì)量濃度在40.4～404 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度（A）與質(zhì)量濃度（C）呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對照蛋白溶液1 mL至試管中，自“加堿性銅溶液5 mL”起，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果，RSD=0.080％（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取供試品內(nèi)容物（批號140729-5）0.1 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，每5 min 1次，共7次。結(jié)果，RSD為1.0％ （n =7），表明溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品內(nèi)容物（批號140729-5）0.1 g，共6份，分置100 mL錐形瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下方法操作，分別測定吸光度，將測定結(jié)果代入線性方程，求得6份供試品溶液的多肽含有量。結(jié)果，RSD為1.2％（n =6），表明該方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品內(nèi)容物（批號140729-5）約0.01 g，置于100 mL錐形瓶中，共取9份，毎3份為一組，每組分別精密加入“2.1.2”項(xiàng)下對照蛋白溶液10.5、15.0、19.5 mL，再加水補(bǔ)足至25 mL，其余按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收試驗(yàn)混合溶液。

各精密量取上述混合溶液1 mL，分置試管中，自“加堿性銅溶液5 mL”起，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定溶液吸光度。將測定結(jié)果代入線性方程，求得9份供試溶液的多肽含有量，由測得量和加入量計算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

2.9 樣品含有量測定 分別精密稱取3個批號的優(yōu)泌嘉膠囊內(nèi)容物，每個批號2份，各約0.1 g，置于100 mL錐形瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定溶液吸光度，將測定結(jié)果代入線性方程計算多肽含有量。結(jié)果，3批供試品中多肽含有量分別為15.19％、14.91％、15.26％，平均15.12％（RSD= 1.2％），即本品每粒膠囊內(nèi)容物（0.33 g）中多肽平均含有量為49.90 mg。

3 討論

福林酚比色法的反應(yīng)原理為蛋白質(zhì)或多肽含有的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性條件下，與銅試劑中的Cu2 +反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)（多肽）-銅復(fù)合物，該復(fù)合物中的芳香族氨基酸殘基可還原酚試劑中的磷鉬酸鹽和磷鎢酸鹽，生成深藍(lán)色的化合物，溶液顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)或多肽含有量呈正相關(guān)。該法是雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)或多肽反應(yīng)的疊加，靈敏度高。此外，雙步反應(yīng)引起的顯色效果增強(qiáng)可減少蛋白質(zhì)種類差異所致的偏差，具有較強(qiáng)的抗干擾能力［2-4］。故在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中普遍采用此法測定水溶性蛋白質(zhì)和肽類的含有量。

供試品蛋白種類和濃度均影響測定波長的選擇?！吨袊幍洹芳拔墨I(xiàn)中本法常用的顯色波長分別是650、660和750 nm［5-9］。本實(shí)驗(yàn)取對照蛋白溶液和供試品溶液，分別在400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)二者的吸收變化一致，均在773.50 nm處有最大吸收，最終確定以與該波長相近的750 nm為顯色波長。

在測定時應(yīng)注意，酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，但顯色反應(yīng)只在堿性條件時才發(fā)生，所以加酚試劑時必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱［10］。同時，堿性銅溶液和福林酚溶液應(yīng)臨用前配制，避免試液發(fā)生變質(zhì)，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)中精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值均小于2％，平均回收率在98％ -102％之間，RSD值小于2％。由此表明，建立的方法簡單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于優(yōu)泌嘉膠囊中多肽的含有量測定。

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Determ ination of polypeptide in Youm ijia Capsules by Folin-phenol colorimetry

WEIGuo， BIAN Hai-xu， XIMiao-miao， WENG Yan， DUAN Jia-1in， WEN Ai-dong*
（Department of Pharmacy，Xijing Hospital Affiliated to The Fourth Military Medical University，Xi'an 71OO32，China）

ABSTRACT：AIM To app1y Fo1in-pheno1co1orimetry to determining the contentof po1ypeptide in Youmijia Capsu1es（Chrysomyia megacephala）.METHODS A1ka1ine copper and fo1in-pheno1so1utionswere added into samp1es to revea1absorbance at the detection wave1ength of750 nm by u1travio1et spectrophotometer.RESULTS The 15.12％average content of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es，meaning a 49.90 mg po1ypeptide content ca1cu1atedbook=92,ebook=98（a capsu1e weight of0.33 g）.The 1inear range of po1ypeptide waswithin 40.4 -404 μg/mL（r=0.999 0）.The RSDs of precision，stabi1ity and reproducibi1ity tests were a11 1ower than 2％.The average recovery was 99.6％ with the RSD of 0.96％（n =9）.CONCLUSION The estab1ished method is simp1e and re1iab1e for the assessment of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es.

KEY WORDS：Youmijia Capsu1es；po1ypeptide；Fo1in-pheno1co1orimetry

*通信作者：文愛東（1964—），男，主任藥師，博士生導(dǎo)師，主要從事合理用藥與新藥研發(fā)。Te1：（029）84773636，E-mai1：adwen-2012@hotmai1.com

作者簡介：衛(wèi) 國（1987—），男，碩士，藥師，主要從事新藥研究與開發(fā)。Te1：（029）84775475-8210，E-mai1：qigaidaren@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81470174）；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院學(xué)科建設(shè)助推計劃重大新藥研發(fā)項(xiàng)目（XJZT14D06）

收稿日期：2015-05-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.019

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0091-03