衛(wèi) 國， 邊海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文愛東

（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

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福林酚比色法測定優(yōu)泌嘉膠囊中多肽

衛(wèi) 國， 邊海旭， 奚苗苗， 翁 琰， 段佳林， 文愛東*

（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

摘要：目的 采用福林酚比色（Lowry）法測定優(yōu)泌嘉膠囊（五谷蟲）中多肽含有量。方法 優(yōu)泌嘉膠囊水提液中加入堿性銅試液和福林酚溶液后，紫外-可見分光光度法在750 nm波長處測定吸光度。結(jié)果 優(yōu)泌嘉膠囊中多肽平均含有量為15.12％，即49.90 mg/粒（以每粒膠囊0.33 g計）。多肽檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為40.4～404 μg/mL（r= 0.999 0），精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2％，平均回收率為99.6％（RSD為0.96％，n =9）。結(jié)論 建立的多肽定量測定方法簡單易行，結(jié)果準確可靠。

關(guān)鍵詞：優(yōu)泌嘉膠囊；多肽；福林酚比色法

優(yōu)泌嘉膠囊是由五谷蟲（麗蠅科動物大頭金蠅Chrysomyia megacephala）蟲體經(jīng)消毒、速凍、打漿、低溫真空凍干、過篩、裝膠囊等工藝制成的膠囊劑，是第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有滋陰降火、健脾益腎、降脂降糖的功效，臨床主要用于糖尿病及其并發(fā)癥。

五谷蟲化學成分復雜，多為高分子有機化合物，主要成分為不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)及肽類［1］。為有效控制該制劑質(zhì)量，保障藥品的安全性和有效性，本實驗采用福林酚比色（Lowry）法測定膠囊中多肽含有量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV2600紫外分光光度計（日本島津公司）；VP-SOOH超聲清洗器（熊貓集團南京電子計量有限公司）；XW-80A渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

1.2 試藥 血清白蛋白（牛）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號140619-201421，純度100％）。優(yōu)泌嘉膠囊（自制，批號分別為140729-5、140729-6、140729-7，0.33 g/粒）。福林酚試劑（國藥集團化學試劑有限公司，批號20140516，生化純）；氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀、硫酸銅都為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備液 取牛血清白蛋白對照品適量，精密稱定20.20 mg，置于20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對照蛋白溶液 精密量取對照品貯備液2.5 mL至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 取10粒優(yōu)泌嘉膠囊內(nèi)容物混勻，精密稱取約0.1 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲處理（功率240 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，再精密稱定質(zhì)量，水補足減失的質(zhì)量，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管，12 000 r/min離心10 min，取上清，即得。

2.2 測定方法 精密量取供試溶液1 mL至試管內(nèi)，加堿性銅溶液5 mL，搖勻，37℃放置10 min，快速加入酚試劑0.5 mL，立即搖勻，37℃下放置30 min，顯色后，冰浴5 min，按照紫外-可見分光光度法（附錄ⅡA），在波長750 nm處測定吸光度。精密量取水1 mL，自“加堿性銅溶液5 mL”起，同法操作，作為空白對照。

2.3 檢測波長的確定 取對照蛋白溶液和供試品溶液，分別在400～800 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)二者的吸收變化一致，均在773.50 nm處有最大吸收。最終確定，以與該波長相近的常用波長750 nm為顯色波長。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項下對照品貯備液（質(zhì)量濃度為1 010 μg/mL），梯度稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為40.4、80.8、121.2、202、404 μg/mL的蛋白溶液，按“2.2”項下方法操作。以吸光度（A）對質(zhì)量濃度（C）進行直線回歸，得線性方程為A=0.002C+0.076 6（r= 0.999 0），表明蛋白質(zhì)量濃度在40.4～404 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度（A）與質(zhì)量濃度（C）呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密量取“2.1.2”項下對照蛋白溶液1 mL至試管中，自“加堿性銅溶液5 mL”起，按“2.2”項下方法操作，測定吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果，RSD=0.080％（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取供試品內(nèi)容物（批號140729-5）0.1 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下方法操作，測定吸光度，每5 min 1次，共7次。結(jié)果，RSD為1.0％ （n =7），表明溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取供試品內(nèi)容物（批號140729-5）0.1 g，共6份，分置100 mL錐形瓶中，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下方法操作，分別測定吸光度，將測定結(jié)果代入線性方程，求得6份供試品溶液的多肽含有量。結(jié)果，RSD為1.2％（n =6），表明該方法重復性好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取本品內(nèi)容物（批號140729-5）約0.01 g，置于100 mL錐形瓶中，共取9份，毎3份為一組，每組分別精密加入“2.1.2”項下對照蛋白溶液10.5、15.0、19.5 mL，再加水補足至25 mL，其余按“2.1.3”項下方法制備加樣回收試驗混合溶液。

各精密量取上述混合溶液1 mL，分置試管中，自“加堿性銅溶液5 mL”起，按“2.2”項下方法操作，測定溶液吸光度。將測定結(jié)果代入線性方程，求得9份供試溶液的多肽含有量，由測得量和加入量計算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

2.9 樣品含有量測定 分別精密稱取3個批號的優(yōu)泌嘉膠囊內(nèi)容物，每個批號2份，各約0.1 g，置于100 mL錐形瓶中，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下方法操作，測定溶液吸光度，將測定結(jié)果代入線性方程計算多肽含有量。結(jié)果，3批供試品中多肽含有量分別為15.19％、14.91％、15.26％，平均15.12％（RSD= 1.2％），即本品每粒膠囊內(nèi)容物（0.33 g）中多肽平均含有量為49.90 mg。

3 討論

福林酚比色法的反應原理為蛋白質(zhì)或多肽含有的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性條件下，與銅試劑中的Cu2 +反應，生成蛋白質(zhì)（多肽）-銅復合物，該復合物中的芳香族氨基酸殘基可還原酚試劑中的磷鉬酸鹽和磷鎢酸鹽，生成深藍色的化合物，溶液顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)或多肽含有量呈正相關(guān)。該法是雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)或多肽反應的疊加，靈敏度高。此外，雙步反應引起的顯色效果增強可減少蛋白質(zhì)種類差異所致的偏差，具有較強的抗干擾能力［2-4］。故在國家藥品標準中普遍采用此法測定水溶性蛋白質(zhì)和肽類的含有量。

供試品蛋白種類和濃度均影響測定波長的選擇?！吨袊幍洹芳拔墨I中本法常用的顯色波長分別是650、660和750 nm［5-9］。本實驗取對照蛋白溶液和供試品溶液，分別在400～800 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)二者的吸收變化一致，均在773.50 nm處有最大吸收，最終確定以與該波長相近的750 nm為顯色波長。

在測定時應注意，酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，但顯色反應只在堿性條件時才發(fā)生，所以加酚試劑時必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱［10］。同時，堿性銅溶液和福林酚溶液應臨用前配制，避免試液發(fā)生變質(zhì)，導致測定結(jié)果不準。

本實驗中精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD值均小于2％，平均回收率在98％ -102％之間，RSD值小于2％。由此表明，建立的方法簡單易行，結(jié)果準確可靠，可以用于優(yōu)泌嘉膠囊中多肽的含有量測定。

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Determ ination of polypeptide in Youm ijia Capsules by Folin-phenol colorimetry

WEIGuo， BIAN Hai-xu， XIMiao-miao， WENG Yan， DUAN Jia-1in， WEN Ai-dong*
（Department of Pharmacy，Xijing Hospital Affiliated to The Fourth Military Medical University，Xi'an 71OO32，China）

ABSTRACT：AIM To app1y Fo1in-pheno1co1orimetry to determining the contentof po1ypeptide in Youmijia Capsu1es（Chrysomyia megacephala）.METHODS A1ka1ine copper and fo1in-pheno1so1utionswere added into samp1es to revea1absorbance at the detection wave1ength of750 nm by u1travio1et spectrophotometer.RESULTS The 15.12％average content of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es，meaning a 49.90 mg po1ypeptide content ca1cu1atedbook=92,ebook=98（a capsu1e weight of0.33 g）.The 1inear range of po1ypeptide waswithin 40.4 -404 μg/mL（r=0.999 0）.The RSDs of precision，stabi1ity and reproducibi1ity tests were a11 1ower than 2％.The average recovery was 99.6％ with the RSD of 0.96％（n =9）.CONCLUSION The estab1ished method is simp1e and re1iab1e for the assessment of po1ypeptide in Youmijia Capsu1es.

KEY WORDS：Youmijia Capsu1es；po1ypeptide；Fo1in-pheno1co1orimetry

*通信作者：文愛東（1964—），男，主任藥師，博士生導師，主要從事合理用藥與新藥研發(fā)。Te1：（029）84773636，E-mai1：adwen-2012@hotmai1.com

作者簡介：衛(wèi) 國（1987—），男，碩士，藥師，主要從事新藥研究與開發(fā)。Te1：（029）84775475-8210，E-mai1：qigaidaren@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81470174）；第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院學科建設助推計劃重大新藥研發(fā)項目（XJZT14D06）

收稿日期：2015-05-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.019

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0091-03