蒲 彬 施陽陽 劉燕林 左少純 吳麗莉

(1新疆和田蠶桑科學(xué)研究所，新疆和田 848000; 2新疆和田玉圣科技有限責(zé)任公司，新疆和田 848000)

蛹蟲草的蠶蛹活體培養(yǎng)和蠶蛹粉培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)及主要成分的比較分析

蒲 彬1施陽陽1劉燕林1左少純2吳麗莉1

(1新疆和田蠶?？茖W(xué)研究所，新疆和田 848000;2新疆和田玉圣科技有限責(zé)任公司，新疆和田 848000)

對(duì)采用蠶蛹活體注射接種和在小麥+大米+蠶蛹粉混合培養(yǎng)基(以下簡稱混合培養(yǎng)基)表面噴灑接種蛹蟲草菌2種方法培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的主要成分進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明:蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，腺苷含量為184 mg/kg，比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的腺苷含量(102 mg/kg)高80.39%;氨基酸總量(215 800 mg/kg)比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草(165 600 mg/kg)高30.31%，必需氨基酸含量(94 200 mg/kg)比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草(63 900 mg/kg)高47.42%;未檢測(cè)出鉛的含量(低于0.005 mg/kg)，汞的含量(0.012 mg/kg)也低于混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的含量(0.015 mg/kg)，鉛、汞的含量遠(yuǎn)低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2012《食品中污染物限量》的限量要求。

蠶蛹蟲草;培養(yǎng)基;蟲草素;氨基酸;蟲草多糖

蛹蟲草是著名的食藥用真菌，其藥理作用和藥用成分與冬蟲夏草極其相近，其菌體內(nèi)含有多種營養(yǎng)成分和藥用成分，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、膳食、保健等領(lǐng)域，市場需求量大，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1－3］。新疆和田蠶桑科學(xué)研究所從2006年就開始著手進(jìn)行蠶蛹蟲草的培養(yǎng)試驗(yàn)，包括干蛹培養(yǎng)基接種蛹蟲草菌試驗(yàn)、活蠶接種蛹蟲草菌試驗(yàn)等。本試驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)蠶蛹活體注射接種蛹蟲草菌和小麥+大米+蠶蛹粉培養(yǎng)基(以下簡稱混合培養(yǎng)基)表面噴灑接種蛹蟲草菌培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的主要成分進(jìn)行了比較分析，試驗(yàn)結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試試劑及材料 洋蔥、大米、小麥、醫(yī)用75%消毒酒精均為市售;酵母粉為分析純;鮮活家蠶蛹和蠶蛹粉均由新疆和田蠶?？茖W(xué)研究所提供;蛹蟲草菌菌種由山東德州東方生物技術(shù)研究所提供，并經(jīng)過試種后活化轉(zhuǎn)接培養(yǎng)而得。

1.1.2 供試儀器設(shè)備 SW－CJ－1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;THZ－300型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，江蘇太倉試驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品;LDZX－30KBS型立式滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;DHG－9076A型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;JY20002型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品;KFR－35GW空調(diào)，美的集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品;LED蟲草培養(yǎng)燈，聊城金星食用菌設(shè)備有限公司產(chǎn)品;1.5 m的4層培養(yǎng)架，自制;750 mL罐頭瓶、1 000 mL蟲草培養(yǎng)盒，均為市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 (1)液體培養(yǎng)基的制備。按參考文獻(xiàn)［4］的方法將洋蔥100.0 g、酵母粉5.0 g、蠶蛹粉10.0 g、蒸餾水1 000 mL配制成液體培養(yǎng)基，將配制好的液體培養(yǎng)基200 mL裝入容量為500 mL的三角瓶中，三角瓶用透氣封口塞封口，放入LDZX－30KBS型立式滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min，冷卻至室溫后放入超凈臺(tái)待用。(2)混合培養(yǎng)基的制備。按參考文獻(xiàn)［5］的方法將小麥25.0 g、大米25.0 g、蠶蛹粉5.0 g裝入容量為1 000 mL的蟲草培養(yǎng)盒中，混合均勻后按料水質(zhì)量比為1∶1.3加水配制成混合培養(yǎng)基。靜置1晚，待培養(yǎng)料充分吸水膨脹后，置于LDZX－30KBS型立式滅菌鍋內(nèi)121℃高溫濕熱滅菌2 h(或100℃高溫濕熱滅菌10 h)，待滅菌后的培養(yǎng)料充分冷卻后移入接種室待用。

1.2.2 蠶蛹活體接種培養(yǎng) (1)蠶蛹活體接種用蛹蟲草菌的準(zhǔn)備。在無菌條件下用接種鉤鉤取3塊長0.5 cm活化后的蛹蟲草母種菌絲，移入裝有200 mL無菌水的500 mL三角瓶(裝有15粒直徑4 cm的玻璃珠)內(nèi)震蕩1 min，制成蛹蟲草菌菌絲體懸液備用。(2)蠶蛹活體蛹蟲草菌的接種。選擇化蛹2～3 d的新鮮、健康的蠶蛹，用75%的醫(yī)用酒精對(duì)蠶蛹體表快速進(jìn)行消毒后，用1 mL微量注射器吸取蛹蟲草菌菌絲體懸液，按每頭蠶蛹注射16.7 μL(1 mL菌絲體懸液約接種60頭蠶蛹)對(duì)蠶蛹進(jìn)行注射接種，注射接種好的蠶蛹盛于培養(yǎng)盤內(nèi)，平鋪1層，注射接種約1萬頭活蛹。(3)僵化培養(yǎng)。將注射接種了菌絲體懸液的蠶蛹移入預(yù)先消毒好的房間，保持室內(nèi)溫度20℃，相對(duì)濕度60%，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，保持每日室內(nèi)通風(fēng)1 h，同時(shí)室內(nèi)設(shè)置滅蟲燈等設(shè)備，防止蚊蠅等有害生物侵害蛹體，經(jīng)過7～10 d，蛹體內(nèi)逐漸被蛹蟲草菌侵染，蛹體僵化。(4)菌絲體培養(yǎng)。蛹體僵化后對(duì)其進(jìn)行整理，剔除被污染的腐敗蠶蛹，將未被污染的僵化的蛹體裝入750 mL的罐頭瓶內(nèi)，鋪滿750 mL罐頭瓶瓶底底面1層，不要重疊，蓋保濕透氣蓋或覆蓋保鮮膜，室內(nèi)保持溫度20℃，培養(yǎng)瓶內(nèi)相對(duì)濕度約85%，經(jīng)過4 d左右，可從蛹體的節(jié)間褶皺處看到有菌絲長出蛹體，蛹蟲草菌菌絲體培養(yǎng)完成。(5)子實(shí)體原基培育。將盛有完成蛹蟲草菌菌絲體培養(yǎng)的蛹體的750 mL罐頭瓶移入裝有LED蟲草培養(yǎng)燈的培養(yǎng)架上，通過調(diào)節(jié)光照、溫差、氣流等方式促進(jìn)菌絲轉(zhuǎn)色和子實(shí)體原基的形成，經(jīng)過4 d左右的培育，形成子實(shí)體原基。(6)出草管理。在蛹體形成子實(shí)體原基后，保持培養(yǎng)室室內(nèi)溫度20℃，培養(yǎng)瓶內(nèi)相對(duì)濕度約85%，每日例行通風(fēng)換氣，600 Lx左右散射光照射8 h，經(jīng)過30 d左右的培養(yǎng)，子實(shí)體培養(yǎng)完畢，為保證最佳營養(yǎng)成分，需在蛹蟲草菌孢子粉形成前進(jìn)行采收，采收完畢后于60℃烘干至含水率15%以下后低溫避光保存。

1.2.3 混合培養(yǎng)基培養(yǎng) (1)液體培養(yǎng)基菌種的培養(yǎng)。在無菌條件下用接種鉤鉤取3塊長0.3 cm的活化后的蛹蟲草母種菌絲移入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入THZ－300型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中，在 20℃下靜置培養(yǎng) 24 h后，在轉(zhuǎn)速為120 r/min、溫度為18℃的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，當(dāng)培養(yǎng)液中出現(xiàn)菌絲球時(shí)，再培養(yǎng)2 d即可以在試驗(yàn)中使用。(2)混合培養(yǎng)基蛹蟲草菌的接種。在無菌條件下將1.2.3項(xiàng)“(1)液體培養(yǎng)基菌種的培養(yǎng)”獲得的液體培養(yǎng)基菌種用快速攪拌器攪拌以破碎菌絲球，防止因菌絲球體積過大堵塞接種槍，然后用無菌水將破碎了菌絲球的液體培養(yǎng)基菌種稀釋10倍，用接種槍吸取3 mL破碎了菌絲球的液體培養(yǎng)基菌種均勻地噴灑到1.2.1項(xiàng)“(2)混合培養(yǎng)基的制備”獲得的混合培養(yǎng)基表面。(3)菌絲體培養(yǎng)。將噴灑接種了液體培養(yǎng)基菌種的培養(yǎng)盒移入發(fā)菌室，控制發(fā)菌溫度為18～20℃，并且保證每日通風(fēng)換氣2 h，經(jīng)過10 d左右的黑暗培養(yǎng)，蛹蟲草菌菌絲完全深入培養(yǎng)料，完成菌絲體培養(yǎng)。(4)子實(shí)體原基培育。將完成菌絲體培養(yǎng)的培養(yǎng)盒移入裝有LED蟲草培養(yǎng)燈的培養(yǎng)架上，開蓋套保鮮膜，并且在保鮮膜上扎1～3個(gè)小孔，通過調(diào)節(jié)光照、溫差、氣流等方式刺激菌絲體轉(zhuǎn)色和子實(shí)體原基形成，經(jīng)過10 d左右的培育，菌絲體完成轉(zhuǎn)色，形成子實(shí)體原基。(5)出草管理。菌絲體完成轉(zhuǎn)色、形成子實(shí)體原基后，保持培養(yǎng)室室內(nèi)溫度20℃，相對(duì)濕度85%，每日例行通風(fēng)換氣，800 Lx左右散射光照射8 h，經(jīng)過45 d左右的培育，子實(shí)體培育完畢，為保證蛹蟲草最佳營養(yǎng)成分，需在蛹蟲草菌孢子粉形成前進(jìn)行采收，采收完畢后于60℃烘干至含水率15%以下后低溫避光保存。

1.2.4 成分檢測(cè) 將蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草子實(shí)體各800 g(固態(tài)，含水率為15%)送譜尼測(cè)試中心(北京)實(shí)驗(yàn)室，分別依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)［6］、GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》［7］、GB/T 5009.17—2003《食品中總汞及無機(jī)汞的測(cè)定》［8］、GB 5009.12—2010《食品中鉛的測(cè)定》［9］進(jìn)行藥用活性成分(蟲草素等)、營養(yǎng)成分(氨基酸)、重金屬(鉛、汞)等的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺苷等藥用活性成分含量

從表1可以看出，蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，腺苷含量為184 mg/kg，比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的腺苷含量(102 mg/kg)高80.39%;但蟲草多糖(1 800 mg/kg)的含量比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的蟲草多糖含量(2 400 mg/kg)低25.00%，蟲草素(8 954 mg/kg)的含量也略低于混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草(9 403 mg/kg)，而且因檢測(cè)時(shí)操作不當(dāng)未檢測(cè)到蟲草酸。

表1 蠶蛹活體注射接種和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的活性成分含量 mg/kg

2.2 氨基酸含量

從表2可以看出，蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，除了酪氨酸(Tyr)的含量略低于混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草外，其余17種氨基酸含量均高于混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，氨基酸總量比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草高30.31%，必需氨基酸比混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草高47.42%。

表2 蠶蛹活體注射接種和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的氨基酸含量 mg/kg

2.3 重金屬含量

從表3可以看出，蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，未檢測(cè)到鉛的含量，汞的含量(0.012 mg/ kg)也低于混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的含量(0.015 mg/kg)。而且這2種蠶蛹蟲草的重金屬(鉛、汞)含量均遠(yuǎn)低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2012《食品中污染物限量》［10］的限量要求。

表3 蠶蛹活體注射接種和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的重金屬含量 mg/kg

3 小結(jié)與討論

檢測(cè)結(jié)果表明:用新疆和田蠶?？茖W(xué)研究所提供的蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草均含有大量的營養(yǎng)及功效成分。蠶蛹活體注射接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，除未檢到蟲草酸、蟲草多糖略低外，其他營養(yǎng)及功效成分均高于冬蟲夏草和柞蠶蛹蟲草［11－12］;而混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草，除蟲草素較高外，其他營養(yǎng)及功效成分均低于冬蟲夏草和柞蠶蛹蟲草［11－12］。當(dāng)然檢測(cè)機(jī)構(gòu)、試驗(yàn)方法不同可能導(dǎo)致不同的檢測(cè)結(jié)果，具體這幾種蟲草的營養(yǎng)及功效成分含量在相同試驗(yàn)方法、相同檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。但是，從食品安全的角度考慮，用新疆蠶蛹活體注射接種和混合培養(yǎng)基表面噴灑接種培養(yǎng)得到的蠶蛹蟲草的重金屬含量(鉛、汞)遠(yuǎn)低于國家對(duì)食用菌及其制品的規(guī)定，值得推廣。在今后的工作中，我們將繼續(xù)進(jìn)行蠶蛹蟲草的高產(chǎn)、深加工、藥用活性成分、有害微生物等方面的研究。

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S886.9

B

1007－0982(2016)03－0041－04

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.03.010

2016－04－27;接受日期:2016－07－04

新疆維吾爾自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(編號(hào)2013012);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào)CARS－22)。

第1作者信息:蒲彬(1982—)，男，四川綿竹，本科，農(nóng)藝師。Tel:0903－2091071，E-mail:pubin1@163.com