陳興奎

（遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧錦州121017）

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高通量測序技術(shù)及EST-SSR標(biāo)記在蔬菜研究上的應(yīng)用

陳興奎

（遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧錦州121017）

高通量測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)（Nextgeneration sequencingtechnology），1次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，與以往的測序技術(shù)相比，其特點是通量高、測序成本顯著降低、測序時間顯著縮短。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）是利用高通量測序技術(shù)直接對由mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA序列進行測序，產(chǎn)生數(shù)以千萬計的reads數(shù)量，從而使得基因組區(qū)域中不同基因的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過比對到該基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量[1]。在已完成基因組測序的物種中，可將RNA-seq結(jié)果與基因組DNA序列數(shù)據(jù)進行對比，從而得到基因表達、可變剪切、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、新基因發(fā)現(xiàn)等分析結(jié)果。對于沒有參考基因組的物種，可以進行de novo轉(zhuǎn)錄組測序研究，即對所得到測序讀長片段進行de novo組裝，進而得到該物種的單一基因序列集（unigenes）數(shù)據(jù)[2]。

迄今，國內(nèi)外已有多篇關(guān)于利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)對植物抗病相關(guān)基因進行分析研究的報道。李湘龍等[3]對水稻和稻瘟菌互作早期轉(zhuǎn)錄組進行了測定和分析，克隆和鑒定在互作早期表達的稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因，從總計約12.5M條序列標(biāo)簽中分離和鑒定了338942條來源于稻瘟菌的序列，并最終定位到779個稻瘟菌預(yù)測基因，其中108個基因很可能參與了水稻和稻瘟菌互作過程，42個基因為預(yù)測的分泌蛋白基因。通過RT-PCR分析，最終確認(rèn)了42個預(yù)測分泌蛋白基因中有12個基因在侵染水稻早期有顯著的表達，而其中有4個基因表現(xiàn)為侵染早期特異表達。以抗病棉花品種（海島棉品種7124）和黃萎病菌V991菌株為材料，通過RNA-Seq技術(shù)研究了在接種病原菌后棉花植株轉(zhuǎn)錄組的變化，篩選到3442個差異表達基因，揭示了轉(zhuǎn)錄控制的復(fù)雜性，認(rèn)為木質(zhì)素和苯丙途徑在植株對黃萎病菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。王剛[4]通過So?lexa高通量測序的方法對鹽脅迫處理前后的棉花幼苗進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)多受鹽脅迫處理上調(diào)和下調(diào)的基因，揭示了棉花幼苗鹽處理前后轉(zhuǎn)錄組水平復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Fernandez等[5]提取了感染咖啡銹菌21d后的咖啡葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)cDNA，用454轉(zhuǎn)錄組測序平臺（454GS-FLX Titanium）進行了測序，結(jié)果獲得了352146條reads，拼接后有22774個contigs，對測序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)一些與抗病相關(guān)的基因，如PR-5、葡聚糖酶、PR1b、幾丁質(zhì)酶等。在對菜豆（Phaseolusvulgaris L.）利用454轉(zhuǎn)錄組測序方法發(fā)掘抗病基因序列的研究中發(fā)現(xiàn)植物抗病基因大部分都有共同的保守結(jié)構(gòu)域，如NBS、LRR、蛋白激酶（PK）、跨膜結(jié)構(gòu)（TM）和TIR，這些都是R基因的基本結(jié)構(gòu)特征。將轉(zhuǎn)錄組測序后獲得的169萬條序列和GenBank中的116716條ESTs作為參照序列庫和已知的70多個R基因比對，最后發(fā)現(xiàn)了365條非冗余序列有類似的結(jié)構(gòu)，其中有116 （45.48%）條來自于454轉(zhuǎn)錄組測序、147（40.27%）條來自于菜豆的ESTs、52（14.25%）條是兩者都有的[6]。

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以大批量開發(fā)SSR （Simple sequence repeats）分子標(biāo)記。SSR是1類1～6個堿基短片段重復(fù)的DNA鏈，是基因或基因組的普通組分。與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、易操作、對模板DNA質(zhì)量要求低及遍布整個基因組等優(yōu)點。因此，在植物遺傳研究的很多方面得以應(yīng)用[7]。由于基因組SSR沒有基因功能，一般和基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)不能緊密連鎖，而EST-SSR是和功能基因緊密連鎖，甚至它本身就是功能基因的一部分[8]。所以EST-SSR在分子育種標(biāo)記輔助選擇上更為重要。另外EST-SSR來源于物種間保守的表達序列，因此它在相似物種間具有很高的轉(zhuǎn)移性[9]，非常適合于物種間的比較基因組學(xué)的研究。隨著NCBI數(shù)據(jù)庫中EST序列數(shù)目的劇增，越來越多的EST-SSR標(biāo)記被開發(fā)出來，并且被廣泛的應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、比較作圖、基因定位、DNA指紋圖譜構(gòu)建、生物遺傳多樣性以及許多物種的進化研究上。目前在動植物中都開發(fā)了大量的EST-SSR標(biāo)記，并在各類研究中進行利用，如葡萄（V.vinifera）、甘蔗（Sacchar?umspp.）、硬粒小麥（Triticumdurum）、黑麥（Secale ce?reale L）、大麥（Hordeumvulgare L.）、小麥（Triti?cumaestivumL.）、水稻（Oryza sativa L.）、馬鈴薯（So?lanumtuberosumL）、香蕉（Musa nana Lour.）、萵苣（Lactuca sativa L.）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、花生（Arachishypogaca）、蓖麻（Ricinus communis L.）、木薯（Manihot esculenta Crantz）、豌豆（Lathyrus sativus L.）、蘿卜（Raphanus sativus L.）、辣椒（Capsicumspp.）等。

隨著越來越多的重要農(nóng)作物、栽培品種或模式植物的全基因組被測定，可以預(yù)見到不久的將來，科學(xué)家們能高效對農(nóng)作物不同栽培品種進行深入、高效、準(zhǔn)確的遺傳差異分析、分子標(biāo)記分析、連鎖圖譜分析、表觀遺傳學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究，利用分析結(jié)果改進農(nóng)作物的育種技術(shù)，加快新品種的育種研究，從而使現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)在提高農(nóng)作與產(chǎn)量、質(zhì)量、減少農(nóng)業(yè)成本、保護生態(tài)環(huán)境等方面大顯身手。

參考文獻

[1] Ansorge W.J.Next- generation DNA sequencingtech?niques[J].N Biotechnol，2009，25（4）:195～203.

[2]岳桂東，高強，羅龍海，等.高通量測序技術(shù)在動植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2012，42（2）: 107～124.

[3]李湘龍，柏斌，吳俊，等.第二代測序技術(shù)用于水稻和稻瘟病互作早期轉(zhuǎn)錄組的分析[J].遺傳，2012，34（1）:102～ 112.

[4]王剛.棉花幼苗鹽脅迫條件下Solexa轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的分析及驗證[D].碩士畢業(yè)論文，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[5] Fernandez D.，Tisserant E.，Talhinhas P.，et al.454py?ro-sequencingof Coffea arabica leaves infected by the rust fun?gus Hemileia vastatrix reveals in planta-expressed pathogen-se?creted proteins and plant functions in a late compatible plantrust interaction[J].Molecular Plant Pathology，2012，13:17～37.

[6] Liu Z.，Crampton M.，Todd A.，et al.Identification of

（上接P64）

的發(fā)芽雜草可采用藥劑防除，如灰菜、馬齒莧、薺菜和苣荬菜等；深土層中發(fā)芽的雜草如蒼耳、鴨跖草和苘麻等，由于其種子在藥層以下，應(yīng)選用土表處理除草劑。

玉米田中禾本科雜草和闊葉雜草大部分混生，給農(nóng)民選擇除草劑類型帶來一定的難度。再加上外部主觀、客觀因素的干擾，大大降低了化學(xué)除草劑防除雜草的效果。

4.1客觀因素

4.1.1氣象因素

（1）濕度：土壤表面過干或過濕，施藥后不能形成藥土層。（2）溫度：溫度過高，除草劑揮發(fā)、分解量增大，減小了除草劑的實際使用劑量；溫度過低，除草劑活性下降，雜草蠟質(zhì)層增厚，藥劑無法正常進入雜草體內(nèi)。（3）風(fēng)：大風(fēng)加速了除草劑的揮發(fā)和分解，降低了土壤表層濕度。

4.1.2土質(zhì)因素

土壤有機質(zhì)含量高，吸附除草劑能力強，降低了除草劑的有效劑量；土壤鹽堿中和與固定部分除草劑，使除草劑劑量相對下降；鹽堿地中的堿草耐藥性較強。

4.2主觀因素

4.2.1除草劑因素

除草劑本身質(zhì)量問題，如廠家生產(chǎn)工藝不達標(biāo)，農(nóng)民買到不合格產(chǎn)品；多元合劑配比不合理，如合劑中乙草胺含量低、2，4-D丁酯含量偏高，除草效果差，常發(fā)生藥害。

4.2.2人為因素

（1）除草劑選擇不合理：沒有根據(jù)玉米地中雜草群落的數(shù)量和種類正確選用除草劑。（2）施藥方法不正確：苗前封閉用水量小，遇高溫大風(fēng)天中午施藥；苗后用水量大，霧化不好，遇大風(fēng)天施藥等。（3）施藥時間不對：苗前封閉處理的雜草在出土后施藥，苗后莖葉處理的雜草在4葉以后施藥或遇雨施藥等。（4）用藥量不適宜：雜草密度大、惡性雜草多的地塊及鹽堿地沒有適當(dāng)增加用藥量，低溫干旱情況下沒有適當(dāng)加量等。

玉米田化學(xué)除草應(yīng)本著安全、節(jié)約、高效的原則選擇合適劑型、施藥適期、安全有效劑量和正確的施藥方法，以確?；瘜W(xué)除草防效和對玉米生產(chǎn)的安全。

[1]徐明慧，于曉東.玉米田苗后除草劑的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（1）:128～129.

[2]蘇少泉.玉米田除草劑新品種與應(yīng)用[J].農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2009，13（1）:1～6.

[3]邢光耀，魏廣太，楊吉峰.煙嘧磺隆和氯氟吡氧乙酸混配防除玉米田雜草及其安全性[J].農(nóng)藥，2008，47（1）:72～ 73，76.expressed resistancegene-like sequences bydataminingin 454-derived transcriptomic sequences of common bean（Phaseolus vulgaris L）[J].BMC Plant Biol，2012，12∶42～51.

[7] Schlotterer C.The evolution ofmolecularmarkers - just amatter of fashion[J].Nat Rev Genet，2004，5∶63～69.

[8] Bozhko M，Riegel R，Schubert R，et al.A cyclophilin? genemarker confirminggeographicaldifferentiation of Norway spruce populations and indicatingviability response on excess soil-born salinity[J].Mol Ecol，2003，12∶3147～3155.

[9] Scott K.D.，Eggler P.，Seaton G.，et al.Analysis of SSRsderived fromgrape ESTs[J].Theor Appl Genet，2000，100∶723～726.