宋衛(wèi)得,蘇　征,惠希東,袁曉鷹,劉　冰,盧志曉

(日照出入境檢驗檢疫局,山東日照 276826)

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液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品真菌毒素檢測中的研究進展

宋衛(wèi)得,蘇征,惠希東,袁曉鷹,劉冰,盧志曉

(日照出入境檢驗檢疫局,山東日照 276826)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),具有靈敏度高、選擇性好、多種組分同時檢測等技術(shù)優(yōu)點,當前廣泛應用于食品中真菌毒素檢測。本文綜述了近年來國內(nèi)外液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品真菌毒素檢測中主要研究進展,討論了食品中主要真菌毒素的檢測方法,展望了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品檢測中的發(fā)展和應用前景,以期為從事食品質(zhì)量控制和檢測分析人員提供參考。

液相色譜,質(zhì)譜,食品,真菌毒素,檢測

真菌毒素,是真菌在糧食或飼料中生長代謝所產(chǎn)生的一系列有毒有害物質(zhì),目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素多達400多種[1-2]。按照主要產(chǎn)毒菌種,真菌毒素可以分為曲霉菌毒素(如黃曲霉毒素、棕曲霉毒素等)、青霉菌毒素和鐮刀菌毒素(如T-2毒素、HT-2毒素、玉米赤霉烯酮等)等幾大類。真菌毒素具有致癌、致畸、致突變的作用,可引起人體的急性或慢性中毒,嚴重危害人體健康[3]。目前,真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]。薄層色譜法簡捷、便利,但重現(xiàn)性差、精度低;酶聯(lián)免疫法特異性強、前處理簡單,但假陽性率高,不能作為確證方法;液相色譜法穩(wěn)定性好、靈敏度較高,但不能同時分析檢測同系物或異構(gòu)體;氣質(zhì)法需要衍生化前處理、操作費時費力。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),具有選擇性好、靈敏度高、適用性強等技術(shù)優(yōu)勢[5-6],當前已廣泛應用于真菌毒素檢測,并且成為食品檢測領(lǐng)域的研究熱點之一。本文綜述了近年來國內(nèi)外液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品檢測中的重要研究成果,分析了食品中主要真菌毒素的檢測方法,展望了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品檢測中的應用前景,以期為食品質(zhì)量控制和檢驗分析人員提供參考,進一步拓展液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應用空間。

1　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在真菌毒素檢測中的研究

近年來,色譜技術(shù)的更新?lián)Q代和食品檢測技術(shù)的進步,特別是一些新型提取凈化技術(shù)、色譜分離技術(shù)、高分辨質(zhì)譜技術(shù)的涌現(xiàn),極大地推動了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在真菌毒素檢測領(lǐng)域的研究和發(fā)展。

1.1黃曲霉毒素的檢測

黃曲霉毒素(Aflatoxin,簡稱AFT)是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產(chǎn)物[7-8],是真菌毒素中毒性最強、致癌性最高的一類劇毒物質(zhì),其中毒性最大、威脅性最高的B1,它具有極強的致癌、致畸、致突變作用[9-10]。因此,世界各國和地區(qū)對食品中黃曲霉毒素制定了限量要求。目前,AFT的主要檢測方法是液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法,后者檢測靈敏度更高。Hanioka等[11]采用固相微萃取技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的方法,檢測了糧谷中黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2),使用甲醇/乙腈(60/40):5 mmol/甲酸銨(45∶55)為流動相,在選擇離子監(jiān)控模式(SIM)下,使用AFM1作為內(nèi)標,在0.05～2.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線性系數(shù)大于0.9994;在1.0 μg/L濃度時,日內(nèi)及日間方法相對標準偏差RSD在3.3%～7.7%(n=5)之間。該方法精密度高,但內(nèi)標法定量及流動相配制操作相對復雜,實驗檢測步驟繁瑣。Huang等[12]采用HPLC-MS/MS方法測定了花生及其制品中的6種黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2、M1、M2),采用84/16的乙腈/水混合液勻漿提取3 min,經(jīng)一種自制混合固相萃取柱凈化后進樣,經(jīng)Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)分離后6種毒素得到完全分離。該方法創(chuàng)新性較好,其線性、回收率、精密度均符合痕量分析要求,且首次在花生及制品中檢出了AFM1、AFM2。另外,Li等[13]使用UPLC-MS/MS測定了谷物中的B1、B2、G1和G2,其中B1最低檢出濃度可達到0.25 μg/kg。綜合分析發(fā)現(xiàn),HPLC-MS/MS方法檢測黃曲霉毒素的技術(shù)要點有三方面:選擇提取凈化條件、選取合適的定性定量方法及優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件。免疫親和柱法是最常用的AFT凈化方法,特異性高、富集性強,但價格昂貴、操作步驟復雜;多功能柱凈化法,檢測成本低,但回收率偏低。外標法定量操作便捷,但受基體效應影響、回收率不高;內(nèi)標法定性定量相比外標法準確,但內(nèi)標成本高、操作步驟相對復雜。對檢測精度要求較高的實驗室,建議采用成熟的免疫親和柱凈化法結(jié)合內(nèi)標法進行分析檢測。另外,選擇合適的色譜分離和質(zhì)譜分析條件,更是提高檢測技術(shù)的重點和難點。

1.2赭曲霉毒素A的檢測

赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬的霉菌產(chǎn)生的真菌毒素,在赭曲霉毒素中分布最廣、毒性最強、危害最大的是赭曲霉毒素A(Ochrotoxin A,簡稱OTA)[14-15]。赭曲霉毒素A,已被國際癌癥研究機構(gòu)確定為ⅡB類致癌物,具有致癌、致畸、肝腎毒性[16-18]。歐盟于2012年7月發(fā)布(EU)No 594/2012號法規(guī),修訂了OTA在谷物產(chǎn)品中殘留限量為3.0 μg/kg[19],我國真菌毒素標準規(guī)定谷物、豆類中OTA的限量為5.0 μg/kg。

Ryu等[20]建立了一種OTA的UPLC-MS/MS檢測方法,使用乙腈-水(80∶20)為提取劑,經(jīng)過超聲、過濾后,進樣測定。線性系數(shù)大于0.999,回收率在90%～104%之間,檢出限為0.6 μg/kg,且無明顯基體效應影響。該方法前處理簡便、快速,精密度高,對谷物樣品實測效果良好。史娜等[21]研究并建立了液質(zhì)聯(lián)用法檢測食品中OTA,根據(jù)糧谷、咖啡、酒類三類不同基質(zhì)樣品,用甲醇-2%碳酸氫鈉溶液(60∶40)或甲醇-水(80∶20)提取樣品中的OTA,經(jīng)OchraTest親和柱凈化,以甲醇-乙酸銨(含0.1%甲酸)為流動相,采用正離子模式對OTA進行檢測。結(jié)果回收率在82.3%～98.5%之間,檢出限達到了0.1 μg/kg。該方法適用范圍廣、靈敏度高、抗干擾能力強。Wang等[22]采用LC-ESI-MS/MS方法檢測了燕麥、玉米、小麥等110個市場抽選樣品中的OTA,三水平平行檢測的回收率在78.3%～103.3%之間,相對標準偏差RSD為2.1%～4.3%。

查閱大量OTA檢測研究文獻發(fā)現(xiàn),采用乙腈-水作為提取劑,對OTA的提取效果優(yōu)于甲醇-水,前者回收率更高;OTA在弱堿性條件下溶解性更高,因此,很多檢測在提取溶劑中加入少量NaHCO3;對質(zhì)譜掃描模式、碰撞電壓、離子源溫度等分析對比和優(yōu)化選擇,同樣是確保OTA檢測準確性的重要環(huán)節(jié)。

1.3玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的檢測

玉米赤霉烯酮類物質(zhì)(zearalenols,以下簡稱ZER)是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種具有類似雌激素效應的真菌毒素,主要包括玉米赤霉烯酮(ZON)、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮等[23]。大量研究證實,ZER具有生殖毒性、免疫毒性和基因毒性等毒副作用,且具有強烈的致畸作用,人體攝入受污染的食品后會受到嚴重危害[24]。我國真菌毒素限量標準中規(guī)定小麥和玉米中玉米赤霉烯酮不得超過60 μg/kg。目前ZON的檢測方法主要有薄層色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。與其他檢測方法存在檢測組分單一、檢測步驟復雜、定性能力不足等缺點相比[25],液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),具有靈敏度高、選擇性好、多組分同時測定等優(yōu)勢。孟娟等[26]建立了糧食及制品中6種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的UPLC-MS/MS檢測方法。樣品用乙腈-水提取,經(jīng)ENVI-Carb石墨化炭黑(GCB)固相萃取柱富集凈化,用6 mL二氯甲烷-甲醇(7∶3)溶液洗脫,在ACQUITY UPLCTMBEH C18反相柱上分離,采用電噴霧負離子多反應監(jiān)測采集模式。以α-玉米赤霉烯酮-d4為內(nèi)標,檢測線性范圍為0.1～50 μg/L,檢出限為0.1～0.2 μg/kg,3個不同水平的加標平均回收率為79.9%～104.0%。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好,滿足食品中痕量ZER污染物的檢測要求。Pereyra等[27]采用HPLC-MS/MS檢測了儲藏狀態(tài)下玉米中玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮-4-硫酸鹽、β-玉米赤霉烯酮-4-葡糖苷,通過對7～127 d中5種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)含量的監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)在該儲藏條件下,玉米赤霉烯酮及其派生物的含量無顯著變化。

鑒于玉米赤霉烯酮類物質(zhì)性能相近、衍生物之間分子量相差小,在一定流速條件下,應選擇合理的流動相配比(如乙腈-水)和適宜的梯度洗脫條件,來提高分離效果。另外,一些肉類樣品檢測時,基質(zhì)干擾效應強,需要對比選取高效的提取溶劑(如乙醚),采用可行的凈化方法,必要時要采取復合凈化(如IAC-CZ柱)或聯(lián)合凈化方式(如IAC-SPE)。

1.4脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又稱嘔吐毒素,是鐮刀菌屬的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等的次級代謝產(chǎn)物[28],人和動物大量攝入受污染食物后,會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、神經(jīng)紊亂等急性中毒反應,嚴重時會損害造血系統(tǒng)導致死亡[29-30]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),是一種檢測食品中痕量DON的高效、靈敏、準確的方法。

Jestoi等[31]利用在線凈化-液質(zhì)串聯(lián)的方法測定了大麥和小麥中DON和其衍生物DON-3-葡糖苷(簡稱D3G)。采用乙腈-水(84∶16)提取,MycoSep(R)227凈化柱凈化處理,分析了方法的特異性、線性、回收率、精密度(日內(nèi))、檢出限。在DON濃度范圍內(nèi)(0.1～1.6 μg/kg),相關(guān)系數(shù)R2>0.985;回收率在73%～102%之間,RSD為3%～12%,對比分析了DON傳統(tǒng)的固相萃取、免疫親和凈化等前處理方法和文中所用在線凈化方法,表明在線凈化方法快速簡便、靈敏度高。Ohnishi等[32]使用LC-MS法檢測分析了玉米制品中的DON、3-乙?；?DON,15-乙酰基-DON,DON-3-葡萄糖苷。采用了5種多功能凈化柱進行實驗對比,回收率均在96%～120%之間,但對DON-3-葡萄糖苷檢測時只有InertSep VRA-3多功能柱回收率在93.5%左右,實驗數(shù)據(jù)證實,采用InertSep VRA-3凈化柱凈化檢測4種DON及其衍生物結(jié)果更可靠。

目前,液質(zhì)聯(lián)用法對DON及其衍生物同時檢測的檢出限可以達到0.1 μg/kg,遠高于液相色譜法的檢測靈敏度(檢出限60 μg/kg左右)。大量文獻證實,采用乙腈-水提取結(jié)合多功能柱凈化是DON及其衍生物同時測定的一種高效、可靠的前處理方法;為了去除基質(zhì)效應,采用基質(zhì)匹配的方式來制作校準曲線,可有效提高定量分析的準確度。

1.5多種真菌毒素同時檢測

與其他真菌毒素檢測方法相比,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,可以通過保留時間和破碎離子共同完成定性定量分析,具有穩(wěn)定、準確、可靠等技術(shù)特點,其中最顯著的技術(shù)優(yōu)勢就是多類別、多組分真菌毒素同時分析檢測,是一種高選擇性和高靈敏度的真菌毒素檢測方法[33-34]。當前,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對多種真菌毒素同時檢測分析中研究最多的是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZON、DON、伏馬毒素(FB1、FB2)、T-2和HT-2等11種真菌毒素。

Lattanzio等[35]檢測分析了谷物中9種真菌毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZON、DON、T-2和HT-2),采用乙腈-水(84∶16)作為提取劑,聚合固相柱凈化,內(nèi)標法定量,進行了5平行樣品添加回收,添加濃度水平在歐盟對各種真菌毒素的限量附近,除了ZON外,其他毒素回收率均在73%～114%之間,檢出限在0.1～59.2 μg/kg之間,符合食品檢驗的技術(shù)要求。Solfrizzo等[36]做了一項基于玉米中11種真菌毒素LC-MS/(MS)檢測方法的調(diào)查研究,通過對41個實驗室的檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在提取環(huán)節(jié)中,56%的實驗室采用乙腈-水,17%的實驗室采用甲醇-水,15%的實驗室采用PBS(磷酸鹽緩沖液)及甲醇,有極少數(shù)實驗室采用了乙腈-甲醇-水混合液作為提取劑;在凈化環(huán)節(jié)中,58%的實驗室在上機進樣之前進行凈化處理,37%實驗室直接采用提取原液上機檢測,研究發(fā)現(xiàn)后者極易造成色譜柱及整個檢測系統(tǒng)的污染;在定量環(huán)節(jié)中,54%實驗室采用外標法定量,22%實驗室采用歸一化法定量,24%實驗室采用內(nèi)標法定量,實驗數(shù)據(jù)對比分析發(fā)現(xiàn),內(nèi)標法和歸一化法能夠降低基體效應的影響,但當進樣量低于10 mg時外標法檢測結(jié)果更可靠。宮小明等[37]采用同位素稀釋法并結(jié)合凝膠色譜凈化技術(shù),建立了花生、糧油中18種常見真菌毒素的UPLC-MS/MS檢測方法。在樣品中添加同位素內(nèi)標,經(jīng)乙腈-水(84∶16)均質(zhì)提取,凝膠滲透色譜(GPC)凈化,Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱分離,同位素稀釋內(nèi)標法定量。結(jié)果表明,18種真菌毒素在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均不低于0.996;其中12種化合物的定量下限為0.02～0.4 μg/kg,6種負離子的定量下限為0.06～1.0 μg/kg;低、中、高3個加標水平的回收率為80%～96%,相對標準偏差為10.5%～19.6%。該方法具有前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高的優(yōu)點,適用于食品中多組分真菌毒素的痕量分析。Wang Y T等[38]采用乙腈-水-乙酸(79∶20∶1)溶液提取,Oasis HLB固相萃取柱凈化,LC-MS/MS檢測分析了玉米中9種真菌毒素,方法的檢出限、回收率等技術(shù)指標滿足我國食品理化檢測要求,在實測玉米樣品中檢出率最高的三種毒素依次是伏馬毒素B1(23.3%)、玉米赤霉烯酮(6.7%)、黃曲霉毒素B1(6.7%)。

目前,多種真菌毒素同時檢測的前處理凈化方法有免疫親和柱法[39]、多功能柱法[40]、QuEChERS方法[41]、凝膠色譜法[42]等,選擇一種提取凈化方法或根據(jù)基質(zhì)和檢測組分選取多種凈化方法有效組合,確保每種待測組分提取率和回收率均符合檢測要求;結(jié)合前處理技術(shù)來選取色譜質(zhì)譜條件,提高多種毒素聯(lián)合檢測水平,方可實現(xiàn)食品中真菌毒素快速簡便分析、痕量準確分析、綠色節(jié)儉分析的檢測目標。

2　結(jié)語與展望

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),是將液相色譜良好的分離能力與質(zhì)譜準確的定性能力兩者有機結(jié)合,為多種真菌毒素同時檢測提供了一個極具發(fā)展?jié)摿Φ姆较?。目?液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在真菌毒素檢測中應用廣泛,但依然存在諸多不足。一方面很多食品基質(zhì)復雜,單極質(zhì)譜或靈敏性低的質(zhì)譜定性能力不足,這就需耗費大量的人力物力進行實驗探索,改進前處理方法、優(yōu)化色譜條件,來提高檢測靈敏度。另一方面在真菌毒素檢測時,選擇免疫親和柱法穩(wěn)定可靠但檢測成本較高,其他其凈化處理方法相對不穩(wěn)定;選擇外標法定量簡便但不準確,內(nèi)標法準確但標準品成本較高。由于食品樣品種類多、數(shù)量大,如何選擇恰當?shù)那疤幚砑夹g(shù)和定性定量方法,既能保證檢測結(jié)果準確可靠又能有效降低檢測成本,是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在檢測食品中真菌毒素所亟需解決的現(xiàn)實問題。

一種檢測方法的不足和缺陷,必將會隨著儀器設(shè)備的更新和技術(shù)方法的改進而得以解決。目前,液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(LC-QQQ MS),特別是飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)的發(fā)明和應用,極大地提高了真菌毒素檢測靈敏度和準確性[43]。TOF-MS作為一種高分辨、高通量的質(zhì)量分析器,它能夠獲取化合物的精確質(zhì)量,闡明化合物的結(jié)構(gòu)信息,在無需任何標準品的情況下,可以對多種真菌毒素同時分析檢測[44-45]。相信隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的不斷更新和檢測方法的持續(xù)改進,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將會在真菌毒素檢測領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

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Progress in determination of mycotoxins in food by liquid chromatography tandem mass spectrometry technologies

SONG Wei-de,SU Zheng,HUI Xi-dong,YUAN Xiao-ying,LIU Bing,LU Zhi-xiao

(Rizhao Entry-Exit Inspection & Quarantine Burea,Rizhao 276826,China)

Liquid chromatography tandem mass spectrometry technology has the excellence of high sensitivity,good selectivity and simultaneous determination of compounds. Now it has a wide application in determination of mycotoxins in food. In this paper,recent research progress in determination of food by liquid chromatography tandem mass spectrometry technologies were summarized,and determination technologies of main mycotoxins in food were also analyzed. The development and application prospects of this method were discussed,in order to provide

for the people who work in control of food quality and research on determination of mycotoxins.

liquid chromatography;mass spectrometry;food;mycotoxin;determination

2016-03-03

宋衛(wèi)得(1981-)，男，碩士，工程師，研究方向：食品安全及檢測技術(shù)研究，E-mail：woxinyh2006@163.com。

山東出入境檢驗檢疫局科技項目(SK201619)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)17-0395-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.070