張擷華，林愛(ài)清，胡憶玲，韋麗琴

102例慢性HBV感染者病毒基因變異情況分析*

張擷華，林愛(ài)清，胡憶玲，韋麗琴

目的探討乙型肝炎病毒感染者病毒基因分型和變異情況及其臨床意義。方法我院住院和門(mén)診診治的慢性HBV攜帶者53例和慢性乙型肝炎患者49例，取血清，送往北京地壇醫(yī)院肝病研究所進(jìn)行HBV DNA基因測(cè)序。結(jié)果在102例慢性HBV感染者中，HBV B型36例（35.29%），C型59例（57.84%），B/C混合型4例，未定型3例。慢性乙型肝炎組B型17例，C 型28例，B/C混合型3例，未定型1例，攜帶者組B型19例、C型31例、B/C混合型1例、未定型2例（x2=0.32 P=0.57）；在53例攜帶者中，檢出耐藥位點(diǎn)5例（9.4%），其中3例為rtA181T，1例為rtL180M+rtM204V，1例為rtM/V207I突變，在49例慢性乙型肝炎患者中，共檢出耐藥位點(diǎn)13例（26.5%），其中5例為rtA181T，1例為rtL180M+rtM204V，2例為rtM/V207I，2例為rtN236T，1例為rtA181T+rtM204I+rts202N，1例為rtI169V+rtV173D，1例為rtM204I+rtM204L。結(jié)論在HBV攜帶者和慢性乙型肝炎患者均檢出耐藥位點(diǎn)變異，其意義有待于進(jìn)一步探討。

慢性乙型肝炎；病毒基因型；基因耐藥

Hepatitis B；Genotypes；Viral mutation

乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，為雙鏈DNA病毒，其長(zhǎng)鏈（負(fù)鏈）攜帶了病毒的全部遺傳信息，包含4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框架。由于乙型肝炎病毒聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏糾錯(cuò)功能，導(dǎo)致病毒基因變異的發(fā)生十分常見(jiàn)。乙型肝炎病毒基因變異可以引起病毒生物學(xué)特性的改變，導(dǎo)致疾病臨床表現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)后等方面出現(xiàn)一系列新問(wèn)題?？共《臼侵委熽P(guān)鍵，然而不同病毒基因型及基因變異對(duì)藥物的應(yīng)答率存在顯著差異，嚴(yán)重影響藥物的效果，耐藥及無(wú)應(yīng)答患者預(yù)后差，進(jìn)展為肝硬化和肝癌的概率高［1］。本文探討了慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因分型和變異的臨床意義。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象本研究共納入102例慢性乙型肝炎病毒感染者，均為2012年～2013年我院住院及肝病門(mén)診患者，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》［2］，其中慢性HBV攜帶者53例，男35例，女18例，平均年齡33.8±9.2歲，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶正常，在入選前未接受過(guò)抗病毒治療，HBVDNA＞1×107copies/ml，HBeAg陽(yáng)性39例；慢性乙型肝炎患者49例，男39例，女10例，平均年齡48.2±15.7歲，HBeAg陽(yáng)性27例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）核苷類(lèi)似物治療3個(gè)月以上，HBV DNA仍陽(yáng)性；（2）治療過(guò)程中轉(zhuǎn)氨酶出現(xiàn)反復(fù)波動(dòng)；（3）治療過(guò)程中曾出現(xiàn)過(guò)HBV DNA下降或低于檢測(cè)值下線(xiàn)后再次升高。

1.2治療方法給予慢性乙型肝炎患者拉米夫定【葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司】100 mg，1次/d或阿德福韋酯10 mg，1次/d，單用或聯(lián)用治療失敗者考慮為耐藥，且拉米夫定或阿德福韋酯單用或聯(lián)用抗病毒治療時(shí)間為3個(gè)月以上，并在半年內(nèi)未用過(guò)干擾素和其他免疫抑制劑。

1.3血清HBV DNA基因測(cè)序取患者血清，離心，-70℃保存，定期加干冰送往北京地壇醫(yī)院肝病研究所。檢測(cè)方法：①使用德國(guó)Roche MagNA Pure LC全自動(dòng)核酸提取、加樣系統(tǒng)，獲得HBV DNA；②在美國(guó)PE9600擴(kuò)增儀擴(kuò)增；③用Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；④純化產(chǎn)物經(jīng)Beckman測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，然后在美國(guó)Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA的序列和圖譜。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，率的比較采用x2檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，對(duì)可能引起基因耐藥變異的各因素采用Logistic多元回歸分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1慢性HBV感染者基因型分型分布在納入的102例慢性HBV感染者中，HBV B型36例（35.29%），C型59例（57.84%），B/C混合型4例，未定型3例。慢性乙型肝炎組B 型17例，C型28例，B/C混合型3例，未定型1例；攜帶者組B型19例、C型31例、B/C混合型1例、未定型2例。慢性乙型肝炎組與攜帶者組間B、C兩種基因型無(wú)顯著性差異（x2= 0.32，P=0.57）。

2.2耐藥位點(diǎn)檢出情況在53例攜帶者中，檢出耐藥位點(diǎn)5例（9.4%），其中3例為rtA181T，1例為rtL180M+rtM204V，1例為rtM/V207I突變；在49例慢性乙型肝炎患者中，共檢出耐藥位點(diǎn)13例（26.5%），其中5例為rtA181T，1例為rtL180M+rtM204V，2例為rtM/V207I，2例為rtN236T，1例為rtA181T+rtM204I+rts202N，1例為rtI169V+rtV173D，1例為rtM204I+rtM204L。在所有102例受檢者中，在基因B型中檢出耐藥5例（13.9%），在基因C型中檢出耐藥13例（22.0%），兩組檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=2.15，P=0.14）。

2.3影響耐藥變異的多因素回歸分析對(duì)可能影響基因耐藥變異的多種因素（年齡、性別、抗病毒療程、病毒基因型、HBeAg陽(yáng)性）進(jìn)行Logistic回歸分析，首先進(jìn)行單因素分析，試圖篩選出有意義的因素，結(jié)果基因B型和C型之間耐藥變異檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=2.15，P=0.143），HBeAg陽(yáng)性與否無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，年齡、性別之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于未能篩選出有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)因子，無(wú)法進(jìn)一步行多因素回歸分析。

3　討論

乙型肝炎病毒基因型有不同的地理分布，感染不同基因型的乙型肝炎病毒患者經(jīng)治療后HBeAg血清轉(zhuǎn)換、療效、預(yù)后和應(yīng)答率都有差異［3-5］，國(guó)內(nèi)以基因C型和B型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)［6，7］。本研究顯示，B型36例（35.3%），C型59例（57.8%），B/C混合型4例，未定型3例，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

既往研究表明，B基因型感染后導(dǎo)致HBeAb陽(yáng)性率高于C基因型，感染HBV基因B型患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換要早于感染基因C型患者［8］。有人［9，10］在對(duì)131例慢性乙型肝炎患者研究中發(fā)現(xiàn)，各耐藥位點(diǎn)在HBeAg陽(yáng)性組的突變率均高于HBeAg陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與HBeAg更能反映出HBV復(fù)制，具有更強(qiáng)的傳染性有關(guān)。楊彥麟等［11］報(bào)道137例拉米夫定經(jīng)治患者YMDD變異檢出率與基因型無(wú)顯著相關(guān)。Tan［12］在未經(jīng)拉米夫定治療的慢性乙型肝炎患者中發(fā)現(xiàn)YMDD變異與基因B型或基因C型之間存在顯著差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，性別、年齡、基因型等與病毒變異之間無(wú)明確的關(guān)系，無(wú)法對(duì)檢出的耐藥變異進(jìn)行多因素回歸分析，但在抗病毒治療患者中，慢性乙型肝炎患者經(jīng)治療達(dá)到較低拷貝的病毒載量后，如出現(xiàn)病毒載量的上升，最終大多數(shù)患者發(fā)生了病毒變異。因此，一旦發(fā)生基因變異，就有產(chǎn)生臨床耐藥的危險(xiǎn)性，最終導(dǎo)致肝炎復(fù)發(fā)、病情惡化。因此，在治療過(guò)程中，監(jiān)測(cè)基因是否存在病毒學(xué)突破成為臨床治療的需要。

有研究［11，13］顯示基因C型為肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示與B型感染者相比，C型HBV慢性感染者發(fā)生癌變的可能性較大，因此對(duì)于基因C型HBV慢性感染者，應(yīng)定期隨訪(fǎng)，早期干預(yù)。

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（收稿：2016-02-17）

（本文編輯：陳宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.03.025

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：NJZZ11173）

014010內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染病科（張擷華，林愛(ài)清，胡憶玲）；包頭醫(yī)學(xué)院（韋麗琴）

張擷華，女，30歲，碩士研究生，住院醫(yī)師。E-mail：zhangxiehua187448@163.com

林愛(ài)清，E-mail：linda5335@sina.com

Hepatitis B viral gene mutation in 102 patients with hepatitis B viral infectionZhang Xiehua，Lin Aiqing，Hu Yiling，et al.DepartmentofInfectiousDiseases，F(xiàn)irstAffiliatedHospital，BaotouMedicalCollege，Baotou014010，InnerMongolia Autonomous Region，China