蓋珊珊　張偉東

(遼寧師范大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院　大連　116081)

條斑紫菜(Pyropia yezoensis)是自然生長(zhǎng)在寒溫帶海區(qū)的大型海藻,因其具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益,長(zhǎng)期以來在包括我國(guó)北方沿海在內(nèi)的東北亞潮間帶海域廣泛栽培。據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì),中、日、韓三國(guó)的條斑紫菜年產(chǎn)量已達(dá) 5萬噸(干重)以上,產(chǎn)值達(dá)數(shù)億美元(Blouinet al,2011)。與許多紫菜種類的典型生活史一樣(黒木宗尚,1953; 曾呈奎等,1954),條斑紫菜包含葉狀體和絲狀體兩個(gè)世代: 葉狀體是生產(chǎn)和食用的對(duì)象,由絲狀體成熟釋放的殼孢子萌發(fā)發(fā)育而來; 絲狀體能夠以兩種不同的形式存在,不依賴于基質(zhì)、自由生長(zhǎng)的名為自由絲狀體,溶解鈣質(zhì)、鉆入貝殼生長(zhǎng)的被稱作貝殼絲狀體。

相對(duì)于自由絲狀體而言,貝殼絲狀體更容易實(shí)現(xiàn)勻質(zhì)化的生態(tài)因子調(diào)控,并且可以通過洗刷貝殼抑制雜藻生長(zhǎng),因此在紫菜栽培產(chǎn)業(yè)中,一直采用室內(nèi)培育貝殼絲狀體的方式,作為殼孢子的來源。然而,隨著栽培產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的提高,特別是自然氣候條件變化和極端天氣頻繁出現(xiàn),紫菜絲狀體病害問題也日益突顯,其中較常見的包括黃斑病、泥紅病、白霧病、鯊皮病和綠變病等(賁秀林,2007)。盡管在紫菜葉狀體和絲狀體病害的多數(shù)研究中僅發(fā)現(xiàn)單一的致病菌(馬家海,1996; 閆詠等,2002;馬家海等,2007; 嚴(yán)興洪等,2008; 王洪斌等,2011;Guanet al,2013),但無法確定所識(shí)別的致病菌是否為唯一的病原菌,并且無法明確同屬不同種間是否表現(xiàn)出致病性與益生性的差異。例如,閆詠等(2002)發(fā)現(xiàn)檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonas citrea)能夠引起條斑紫菜綠斑病。王洪斌等(2011)認(rèn)為河豚毒素假交替單胞菌(P. tetraodonis)是條斑紫菜絲狀體黃斑病的病原體。但在其它一些研究中,楊銳等(2008)觀察到假交替單胞菌屬在健康紫菜樣本中占優(yōu)勢(shì),而從病爛紫菜中未分離到這類細(xì)菌,提出假交替單胞菌可能與紫菜的健康生長(zhǎng)密切相關(guān)。在對(duì)不同養(yǎng)殖海區(qū)紅藻表面的假交替單胞菌多樣性進(jìn)行分析時(shí),武洪慶等(2013)發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬普遍存在于大型海藻表面,是健康條斑紫菜表面優(yōu)勢(shì)菌之一,為藻類的正常生長(zhǎng)和發(fā)育提供幫助。這些研究結(jié)果提示,物種多樣性可能在紫菜病害發(fā)生過程中發(fā)揮作用。王洪斌等(2011)也認(rèn)為,除了河豚毒素假交替單胞菌外,不能排除黃斑病由其它細(xì)菌引起,或由其它菌群與河豚毒素交替假單胞菌共同作用而致病的可能。目前,人們對(duì)紫菜病害的研究仍局限于分離培養(yǎng)和基于Sanger測(cè)序技術(shù)的低通量檢測(cè)階段,而忽略了多致病菌因素或病原菌增殖導(dǎo)致的菌群失衡對(duì)藻體微環(huán)境的影響。

近幾年來,以邊合成邊測(cè)序策略為特點(diǎn)的第二代高通量測(cè)序技術(shù)逐漸成熟(Ronaghiet al,2001)。它在數(shù)據(jù)信息量的獲得方面較第一代測(cè)序有了巨大突破,既可用于基因組尺度的序列分析,又能進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、基因頻率和轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定等。最為重要的是,第二代測(cè)序技術(shù)的建立與推廣使得通過大規(guī)模、高通量測(cè)定DNA序列有效進(jìn)行微生物的分型鑒定和豐度估計(jì)成為可能,被廣泛應(yīng)用于包括土壤(Roeschet al,2007)、海洋(Huberet al,2007)、人體(Turnbaughet al,2009)、動(dòng)植物(McKennaet al,2008;Cuvelieret al,2010)等環(huán)境樣本的微生物組研究中,并在對(duì)微生物致病性疾病的探索中展現(xiàn)出其技術(shù)優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿ΑＭㄟ^這些分析,可以定義健康機(jī)體共生菌群的范圍和數(shù)量,由微生物種類和數(shù)量上的變化直觀地反映健康或疾病狀況,也可以從組學(xué)尺度預(yù)測(cè)微生物毒力因子(如有機(jī)酸、裂解酶等)在致病過程中發(fā)揮的作用,以及宿主對(duì)微生物群落變化的應(yīng)答等。

本文擬對(duì)發(fā)病范圍廣泛、后果較為嚴(yán)重的貝殼絲狀體黃斑病開展研究,采用第二代測(cè)序技術(shù)揭示健康貝殼絲狀體微生物菌群結(jié)構(gòu)、發(fā)病后菌群的變化及其對(duì)絲狀體生長(zhǎng)的潛在作用。

1　材料和方法

1.1　樣本采集和處理

黃斑病和健康貝殼絲狀體樣本于2014年8月20日采自江蘇省南通市某紫菜育苗場(chǎng)。育苗池海水來自于天然海區(qū),經(jīng)過黑暗沉淀和過濾處理后注入育苗池。從不同育苗池中挑選黃斑病癥狀明顯的貝殼4枚,并從對(duì)應(yīng)池中隨機(jī)采集4枚健康絲狀體貝殼。取樣育苗池海水比重(1.019±0.1),水溫(24.7±0.1)°C,pH=(8.2±0.2)。貝殼絲狀體于自然光周期(12L∶12D)下培養(yǎng),光強(qiáng)約1500lux。

采集貝殼后,用無菌毛刷輕刷附生有患病或健康絲狀體的貝殼表面,用超純水配制的人工海水(比重1.020)重懸,每枚貝殼約收集1mL懸浮物,分別置于1.5mL的離心管中,后于-20°C冰箱中冷凍備用。

1.2　DNA制備和16S rDNA擴(kuò)增

用移液器將 1mL懸浮物樣本吹打重懸,吸取200μL,轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。分別向管中加入裂解液,按照試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit,Qiagen)標(biāo)準(zhǔn)流程制備總DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

對(duì)各樣本16S rRNA的V3高變區(qū)進(jìn)行序列擴(kuò)增。采用 Bartram 等(2011)的方法,在 V3區(qū)正向引物“CCTACGGGAGGCAGCAG”的 5′端加接頭、測(cè)序引物和 4個(gè)隨機(jī)的堿基 N(用于測(cè)序時(shí)初始信號(hào)的識(shí)別),相應(yīng)的在反向引物“ATTACCGCGGCTGCTGG”的 5′端加接頭、索引序列(index)和測(cè)序引物,得到～80bp的一對(duì)引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。分別以8個(gè)樣品的DNA為模板,使用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB)高保真酶擴(kuò)增 V3區(qū),反應(yīng)程序與上述文獻(xiàn)保持一致。使用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物可直接用于測(cè)序。

1.3　文庫質(zhì)量控制和測(cè)序

采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。各樣本回收產(chǎn)物經(jīng)過NanoDrop ND2000 (Thermo)和 Fregment Analyzer (AATI)檢測(cè)濃度和質(zhì)量,按照預(yù)估濃度等摩爾(0.5nmol/L)混合后用于測(cè)序。使用HisSeq2500(Illumina)測(cè)序平臺(tái),配對(duì)末端PE-150測(cè)序。

1.4　數(shù)據(jù)分析

通過識(shí)別index對(duì)各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分選,并濾除低質(zhì)量的 reads(讀長(zhǎng),指高通量測(cè)序中一個(gè)反應(yīng)獲得的測(cè)序序列)。使用FLASH(Mago?et al,2011)默認(rèn)參數(shù),根據(jù)重疊區(qū)將配對(duì)末端 reads拼接成較長(zhǎng)的序列。去除序列前后端引物和合成引物時(shí)添加的4個(gè)N堿基,所得序列進(jìn)入QIIME分析流程(Caporasoet al,2010)。根據(jù)97%的序列相似性,采用uclust聚類方法生成可操作分類單元(OTUs),并基于Greengenes參考序列進(jìn)行分類注釋(DeSantiset al,2006),使用 MEGAN展示和操作分類數(shù)據(jù)(Husonetal,2007)。利用均一化后的OTUs和分類結(jié)果,計(jì)算物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)和樣本間聚類關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1　測(cè)序數(shù)據(jù)量和覆蓋度

受試8個(gè)樣品經(jīng)總DNA提取后(圖1),用于16S rRNA基因擴(kuò)增和高通量測(cè)序。測(cè)序共獲得1.6Gb數(shù)據(jù),平均每個(gè)樣本產(chǎn)生1332818±137411條reads。根據(jù)重疊區(qū)將這些配對(duì)末端reads拼接成了超過500萬條序列,各樣本所得拼接序列數(shù)相近。

圖1　受試樣品總DNA電泳結(jié)果Fig.1　DNA electrophoresis of the samples studied

拼接序列的長(zhǎng)度分布十分集中,絕大多數(shù)序列的長(zhǎng)度不超過 200bp,其中長(zhǎng)度為 171—190bp和191—210bp的序列最多,分別達(dá)到 2938907和2202118條,其余長(zhǎng)度區(qū)間的序列不超過20000條。

采用 uclust聚類(97%相似性),貝殼絲狀體樣本16S rRNA序列共識(shí)別出7833種OTUs。對(duì)測(cè)序覆蓋度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),各樣本 OTUs觀察數(shù)已達(dá)到飽和(Good’s coverage＞0.997),表明該測(cè)序深度能夠較深入地反映取樣環(huán)境下的微生物群落組成。

2.2　貝殼絲狀體附生微生物組成

貝殼絲狀體樣本16S rRNA V3區(qū)與Greengenes參考序列比對(duì)注釋,共識(shí)別出 18個(gè)細(xì)菌門類。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后發(fā)現(xiàn),變形細(xì)菌門(Proteobacteria)在整個(gè)群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),比例約為69.4%—83.6%,其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)(8.8%—22.0%)、放線菌門(Actinobacteria) (1.2%—6.2%)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)(0.6%—4.0%),其余細(xì)菌合計(jì)只占總?cè)郝涞?.6%—4.2%(表1)。

變形細(xì)菌中絕大多數(shù)屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria),此外β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)相對(duì)豐度較高,僅有少量的δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)和 ζ-變形菌綱(Zetaproteobacteria)細(xì)菌。黃桿菌綱(Flavobacteria)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)和放線菌綱(Actinobacteria)等也是貝殼絲狀體微生物群落中豐度較高的類群。

從貝殼絲狀體樣本共識(shí)別出 396個(gè)細(xì)菌屬,其中140個(gè)屬的16S rRNA序列超過100條,94個(gè)屬超過500條。放線菌(Actinobacteria)、Thalassobacter、Marivita、Loktanella、德沃斯氏菌(Devosia)、Maribacter、弧菌(Vibrio)、氫噬胞菌(Hydrogenophaga)、Phaeobacter和Arenimonas等是其中豐度最高的細(xì)菌屬。

表1　健康和黃斑病貝殼絲狀體樣本菌群在門水平的分類Tab.1　Phylum-level taxonomy of shell-boring conchocelis samples of healthy or yellow-spot diseased

2.3　貝殼絲狀體菌群的alpha多樣性

為研究絲狀體患病前后微生物多樣性變化,我們統(tǒng)計(jì)了Chao1、ACE、Shannon和Simpson四種指數(shù)(表2)。所有數(shù)據(jù)均顯示,相對(duì)于健康對(duì)照組,黃斑病貝殼絲狀體的微生物多樣性顯著增加(t-test,P＜0.05),提示發(fā)生病害的絲狀體菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較大程度的改變。

表2　健康和黃斑病貝殼絲狀體樣本菌群的alpha多樣性Tab.2　Alpha diversity of shell-boring conchocelis samples of healthy or yellow-spot diseased

2.4　貝殼絲狀體菌群在樣本間的聚類關(guān)系

為進(jìn)一步揭示健康和患病絲狀體菌群之間的差異,我們基于OTUs組成對(duì)樣本間菌群差異和距離進(jìn)行了加權(quán)的UniFrac主坐標(biāo)分析(PCoA)。健康和黃斑病絲狀體可以被區(qū)分為不同的組(圖2a),且健康組樣本間的距離明顯小于黃斑病組。UPGMA樹在各樣本間顯示出同樣的聚類關(guān)系(圖2b)。該結(jié)果說明健康貝殼絲狀體保持著相似的微生物群落結(jié)構(gòu),而患病后的絲狀體則發(fā)生了不同的變化。造成這種情況的原因可能是原本處于高度相似狀態(tài)、較為穩(wěn)定的健康菌群平衡受到破壞,菌群紊亂使優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的種類和豐度在樣本間變化幅度較大,從而導(dǎo)致疾病組樣品間β多樣性較高。

2.5　患病貝殼絲狀體菌群的物種變化

為識(shí)別導(dǎo)致健康和黃斑病貝殼絲狀體菌群差異的微生物種類,我們比較了相對(duì)豐度較高(16S rRNA序列數(shù)＞500)的93個(gè)細(xì)菌屬在不同樣本組間的分布。健康和黃斑病樣本組間差異顯著(t-test,P＜0.05)的細(xì)菌屬有 39個(gè)(圖 3),其中 29個(gè)在健康樣本中的相對(duì)豐度明顯高于患病組樣本,包括放線菌、噬甲基菌(Methylophaga)、假單胞菌(Pseudomonas)、假蒼白桿菌(Pseudochrobactrum)、Roseicyclus、Jannaschia和Methylotenera等。而Maribacter、Thalassococcus、Glaciecola、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)和硝化螺旋菌(Nitrospira)等 10個(gè)屬在患病組樣本中相對(duì)豐度顯著高于健康組。

3　討論

條斑紫菜養(yǎng)殖過程中的許多病害是由微生物導(dǎo)致的,其特點(diǎn)是發(fā)病快、傳染力強(qiáng)、危害嚴(yán)重,所以有研究者一直在嘗試分離培養(yǎng)紫菜附生菌(Tsukidateet al,1983; 陳國(guó)耀等,1999; 楊銳等,2008; 武洪慶,2012),以期了解共生菌與紫菜健康的關(guān)系并識(shí)別出可能的致病菌。但由于受到技術(shù)發(fā)展水平的限制,只有少數(shù)高豐度的海洋微生物種類能夠被檢測(cè)發(fā)現(xiàn),人們對(duì)紫菜(尤其是貝殼絲狀體)附生菌群的認(rèn)識(shí)還十分有限。

圖2　貝殼絲狀體樣本間的菌群聚類關(guān)系Fig.2　Sample clustering based on bacterial communities

圖3　健康和黃斑病貝殼絲狀體樣本間的微生物差異Fig.3　Bacterial difference between healthy and yellow-spot diseased conchocelis

在對(duì)條斑紫菜附生細(xì)菌的報(bào)道中,假交替單胞菌屬細(xì)菌僅在健康藻體中分離得到,且占有優(yōu)勢(shì),而在患病紫菜中未有發(fā)現(xiàn),因此認(rèn)為該屬與紫菜健康狀態(tài)密切相關(guān)(楊銳等,2008)。但武洪慶等(2013)對(duì)不同養(yǎng)殖海區(qū)紅藻表面假交替單胞菌多樣性進(jìn)行分析,從江蘇如東和射陽的條斑紫菜葉狀體上沒有檢測(cè)到該細(xì)菌存在,因而對(duì)其能否體現(xiàn)健康與病爛紫菜附生細(xì)菌組成的主要差別產(chǎn)生了疑問。在本研究中,有包括放線菌在內(nèi)的29個(gè)屬的細(xì)菌在健康和黃斑病絲狀體樣本組間差異顯著,且與健康狀態(tài)相關(guān)聯(lián),但不包含假交替單胞菌屬,所以該屬不能用于指示絲狀體健康狀態(tài)。不同研究對(duì)于假交替單胞菌認(rèn)識(shí)的差異可能由于藻體世代(葉狀體或絲狀體)交替、海區(qū)環(huán)境等的不同,也可能與采用不同的微生物檢測(cè)方法有關(guān)。

在僅有的條斑紫菜貝殼絲狀體黃斑病研究中,王洪斌等(2011)從江蘇連云港采集患病樣本,利用特定培養(yǎng)基篩選其中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,并通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法鑒定為河豚毒素交替假單胞菌,但存在黃斑病由其它細(xì)菌引起,或由其它菌群與河豚毒素交替假單胞菌共同作用而致病的可能。盡管許多真菌種類也可能是致病的重要因素(馬家海,1996; 馬家海等,2007; Guanet al,2013),但從黃斑病和健康貝殼絲狀體菌群比較來看,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,說明可能有多種細(xì)菌參與了致病過程,并在發(fā)病前后影響絲狀體的生長(zhǎng)狀態(tài)。例如,健康絲狀體中相對(duì)豐度最高的放線菌屬細(xì)菌,因具有廣泛的抗生素生產(chǎn)能力(Mahajanet al,2012),可能在絲狀體生長(zhǎng)中起保護(hù)和屏障作用?；疾〗z狀體中相對(duì)變化顯著且豐度最高的是黃桿菌科(Flavobacteriaceae)細(xì)菌Maribacter。這類細(xì)菌以產(chǎn)黃色素為普遍特征(Nedashkovskayaet al,2004),較廣泛地分布于自然海區(qū)和多種海藻表面(武洪慶,2012),該菌為條件致病菌,在一般情況下不引起感染,僅在特定環(huán)境因子下引起感染和擴(kuò)散,可能具有較強(qiáng)的致病力。例如,有研究者發(fā)現(xiàn)Maribacter的有些種類可能與其它細(xì)菌一起造成甲殼綱動(dòng)物殼體損傷疾病(Chistoserdovet al,2012; Quinnet al,2012)。盡管Maribacter的一些菌株可能對(duì)青霉素、新生霉素和林可霉素等敏感(Huet al,2015),但從食品安全角度出發(fā),應(yīng)盡量避免在病害預(yù)防和控制過程中使用此類抗生素藥物。

雖然沒有對(duì)這些細(xì)菌開展分離和回復(fù)感染實(shí)驗(yàn)(用于驗(yàn)證柯赫氏法則),但本研究篩選出了一些與病害關(guān)聯(lián)的微生物標(biāo)記,縮小了驗(yàn)證范圍,為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選擇提供了參考。另外,光照、溫度和水質(zhì)條件等因素對(duì)紫菜的生理和生長(zhǎng)狀態(tài)十分重要(王淑剛等,2013; 吳海一等,2015),因此在后續(xù)工作中,應(yīng)對(duì)貝殼絲狀體育苗池水的環(huán)境生態(tài)因子和水體微生物群落變化進(jìn)行深入研究,特別是時(shí)間梯度的連續(xù)性分析,以期在相關(guān)病害的檢測(cè)和防治過程中發(fā)揮預(yù)警的作用。

4　結(jié)論

本研究利用第二代測(cè)序技術(shù),獲得了第一個(gè)高通量的條斑紫菜貝殼絲狀體細(xì)菌群落數(shù)據(jù)集,不僅對(duì)高、低豐度細(xì)菌門類加以量化,還從屬水平識(shí)別出近400個(gè)細(xì)菌分類,擴(kuò)大了貝殼絲狀體核心細(xì)菌群落的范圍,并對(duì)健康和黃斑病狀態(tài)下的貝殼絲狀體菌群的進(jìn)行了比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康和黃斑病樣本組間差異顯著的細(xì)菌屬有 39個(gè),其中如放線菌、噬甲基菌和假單胞菌等29個(gè)屬在健康樣本中的相對(duì)豐度顯著高于病患組,與絲狀體健康狀態(tài)密切相關(guān); 而Maribacter、Glaciecola和Acinetobacter等10個(gè)細(xì)菌屬在黃斑病樣本中相對(duì)豐度顯著較高,可能與絲狀體患病有關(guān)。本研究從菌群生態(tài)角度為絲狀體病害的檢測(cè)和預(yù)防提供了有價(jià)值的信息。

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