高瑋瑋　潘寶平　閆春財(cái)①

(1. 天津市河西區(qū)職工大學(xué)　天津　300203; 2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　天津　300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我國(guó)近海重要的經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物。近年來,海水貝類養(yǎng)殖業(yè)中各種病害的爆發(fā)嚴(yán)重制約著行業(yè)的健康發(fā)展。因此,開展軟體動(dòng)物先天性免疫識(shí)別路徑方面的研究尤為重要,能夠?yàn)槠涿庖邔W(xué)理論及病害防治措施提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

軟體動(dòng)物具有非特異性的先天免疫系統(tǒng),其Toll樣受體(TLRs),是一類很重要的模式識(shí)別受體,能夠識(shí)別細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物以及病毒等病原體的侵染(Akiraet al,2006)。有研究表明,TLR3可以識(shí)別雙鏈RNA(dsRNA)的類似物,聚肌苷-脫氧胞苷酸(Poly I:C)(Yamamotoet al,2003),TLR3缺陷型的小鼠還對(duì)巨細(xì)胞病毒呈易感性(Tabetaet al,2004)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)是銜接 Toll樣/白細(xì)胞介素 1受體(Toll/IL-1 receptor,TIR)超家族以及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子。目前在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 TRAFs家族成員有 7個(gè)(TRAF1-7)。Ishida等(1996)通過酵母雙雜交對(duì)于CD40信號(hào)傳導(dǎo)作用的研究時(shí),發(fā)現(xiàn)了能與 CD40作用的TRAF6。其分子包括C端的指環(huán)型鋅指結(jié)構(gòu),兩個(gè)TRAF型鋅指結(jié)構(gòu),N端的coiled-coil結(jié)構(gòu)域以及MATH(Meprin and TRAF homology)結(jié)構(gòu)域。TRAF6是銜接Toll樣/白細(xì)胞介素1受體(Toll/IL-1 receptor,TIR)超家族以及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子,在動(dòng)物機(jī)體的腦、心臟、肝、骨骼肌、腎臟、脾臟等組織中均能表達(dá)。

1　材料與方法

1.1　材料

青蛤樣品采于天津大港海域,選取成體、形態(tài)無顯著差異的個(gè)體[平均殼長(zhǎng)(29.14±1.23)mm,平均殼寬(19.12±0.57)mm,平均殼高(29.52±1.47)mm]。實(shí)驗(yàn)前在通氣海水中暫養(yǎng),海水密度 1.02—1.04g/cm3,水溫21—24℃,pH 7.0,投喂5‰小球藻,一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2　方法

1.2.1青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建及數(shù)據(jù)篩選采用Trizol法提取活體青蛤各組織總RNA,采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法進(jìn)行分離純化。采用Illumina MiSeq二代測(cè)序儀完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)Unigene進(jìn)行 Pathway通路的注釋和預(yù)測(cè)(Panet al,2015),從中篩選得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的類似序列。

1.2.2侵染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所用 Poly I:C濃度為1μg/g。 利用隨機(jī)分組方法選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)置10個(gè)平行試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)組青蛤的閉殼肌內(nèi)注射50μL Poly I:C懸液,對(duì)照組注射等量滅菌海水。注射前準(zhǔn)確稱取青蛤閉殼肌、鰓、性腺、外套膜和肝臟各 50mg,迅速放入液氮中,在預(yù)冷勻漿器中按質(zhì)量體積比 1∶9加入預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行勻漿,4°C,4500r/min離心 15min,取上清備用。分別于注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h 提取血淋巴,4°C,8000r/min離心10min,收集血細(xì)胞,加入1mL Trizol,于–80°C超低溫冰箱冷凍備用。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用篩選得到的青蛤CsTRAF6基因類似序列設(shè)計(jì)引物 Cs TRAF6-S、CsTRAF6-A (表1)并克隆,測(cè)序后與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對(duì)分析;ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ gorf/)預(yù)測(cè)開放閱讀框(ORF); 利用 ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)在線分析蛋白質(zhì)性質(zhì); 使用ProtParam分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理論分子量以及等電點(diǎn);SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)查找蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域; 使用 ClustalX1.83對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并根據(jù)鄰接法(NJ),使用MEGA4.1構(gòu)建基因的物種進(jìn)化樹,采用bootstrap1000個(gè)循環(huán)檢驗(yàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的置信度。

1.2.4CsTRAF6基因在各組織內(nèi)的表達(dá)分析參考(魏星等,2015)方法,將青蛤閉殼肌、鰓、性腺、外套膜和肝臟的上清液與注射 0h的血細(xì)胞分別置于1mL TRIZOL中用于提取總RNA,根據(jù)TaKaRa公司的PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)β-actin基因和克隆得到的 CsTRAF6基因序列分別設(shè)計(jì)引物: β-actin-F,β-actin-R,CsTRAF6-F,CsTRAF6-R (表 1)。反應(yīng)在 iQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增體系20μL,反應(yīng)程序:95°C 預(yù)變性 30s,94°C 變性 5s,60°C 退火 30s,72°C延伸 30s,共 40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)的處理采用 2-ΔΔCT法(Livaket al,2001),數(shù)據(jù)分析利用SPSS軟件進(jìn)行。

表1　實(shí)驗(yàn)中用到的PCR引物Tab.1　PCR primer sequences used in this study

1.2.5Poly I:C侵染后青蛤血淋巴CsTRAF6基因的時(shí)序性表達(dá)分別在注射后 0h、3h、6h、12h、24h、48h提取青蛤血淋巴細(xì)胞總 RNA,方法及引物同1.2.4。反應(yīng)程序: 95°C 預(yù)變性 30s,95°C 變性 5s,58°C退火30s,72°C延伸30s,共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)的處理采用 2-ΔΔCt法,使用 SPSS軟件對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組及空白組的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1　CsTRAF6基因的序列分析

青蛤CsTRAF6基因的ORF為2337bp,能夠編碼出含有778個(gè)氨基酸的多肽。該多肽的估計(jì)分子量為86.59kDa,估計(jì)等電點(diǎn)為6.16。通過SMART在線分析表明CsTRAF6編碼的氨基酸包含RING型鋅指結(jié)構(gòu)(183—221aa),兩個(gè)TRAF型鋅指結(jié)構(gòu)(266—320aa,320—377aa),coiled-coil 結(jié)構(gòu)域(592—624aa)以及MATH結(jié)構(gòu)域(629—756aa)(圖 1)。CsTRAF6基因在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為KP067203。

2.2　CsTRAF6基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BLASTP比對(duì)表明,青蛤CsTRAF6基因的氨基酸與櫛孔扇貝 TRAF6基因的同源性最高,達(dá)到60%。與霸王花青螺Lottia giganteanTRAF6 (XP_009051677.1)、蝦夷扇貝TRAF6基因氨基酸序列同源性分別為56%和48%。利用16個(gè)物種的TRAF6基因(圖2)構(gòu)建的系統(tǒng)樹表明,不同物種的TRAF6基因各自聚成一支,其中哺乳動(dòng)物與軟體動(dòng)物的 TRAF6基因明顯的聚在兩個(gè)分支上,青蛤 CsTRAF6基因與其它軟體動(dòng)物的TRAF6基因聚在一支。果蠅、對(duì)蝦的TRAF6基因分別獨(dú)立聚成一支。刺參與文昌魚的TRAF6基因聚在一個(gè)分支上。由此可見,青蛤CsTRAF6基因的分子生物學(xué)特性與軟體動(dòng)物在分類學(xué)上的進(jìn)化地位的一致性。

圖1　青蛤TRAF6的開放閱讀框及結(jié)構(gòu)域Fig.1　The open reading frame and the structural domain of CsTRAF6

2.3　CsTRAF6基因在組織間的表達(dá)分析

以青蛤β-actin基因作為內(nèi)參對(duì)照,運(yùn)用Real-time PCR方法檢測(cè)青蛤CsTRAF6在血淋巴、閉殼肌、鰓、性腺、外套膜和肝臟中的表達(dá)量(圖 3)。結(jié)果顯示,CsTRAF6在青蛤的六種組織中均能夠表達(dá),而在血淋巴中的表達(dá)水平最高,在閉殼肌中的表達(dá)水平次之,在肝臟的表達(dá)量最低。

圖2　利用鄰接法(NJ)建立的16個(gè)物種的TRAF6基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenetic tree of the amino acid sequences of TRAF6 from 16 species constructed using the Neighbor Joining method

圖3　CsTRAF6基因的組織分布表達(dá)Fig.3　Tissues distribution of CsTRAF6

2.4　CsTRAF6基因在Poly I：C刺激下的表達(dá)分析

青蛤在Poly I:C侵染后,不同時(shí)間點(diǎn)的血淋巴中CsTRAF6基因相對(duì)于β-actin基因的表達(dá)變化如圖4所示。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量在侵染后的 3h時(shí)迅速升高; 表達(dá)量在 6h時(shí)達(dá)到最大值,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05),約為對(duì)照組的3.8倍,并且顯著高于空白組(P＜0.05)。6h后其表達(dá)量開始下降,逐漸恢復(fù)至正常水平。

圖4　Poly I:C感染后青蛤CsTRAF6基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4　Relative expression of CsTRAF6 in C. sinensis after infection with Poly I:C

3　討論

通過青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)篩選得到的青蛤 CsTRAF6基因的類似序列,經(jīng)克隆及二次測(cè)序后,通過BLAST核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得了青蛤CsTRAF6的cDNA序列,其ORF為2337bp,能夠編碼778個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)的CsTRAF6蛋白估計(jì)分子量為86.59kDa,估計(jì)等電點(diǎn)為6.16。通過SMART在線分析CsTRAF6基因編碼的氨基酸序列包含RING型鋅指結(jié)構(gòu)(183—221aa),兩個(gè) TRAF型鋅指結(jié)構(gòu)(266—320aa,320—377aa),coiled-coil結(jié)構(gòu)域(592—624aa)以及MATH結(jié)構(gòu)域(629—756aa)。這些結(jié)構(gòu)域在青蛤中是保守的,表明它們具有與哺乳動(dòng)物TRAF6s 基因類似的功能。相關(guān)研究表明,N端RING型鋅指結(jié)構(gòu)與 TRAF型鋅指結(jié)構(gòu)用于激活 IKK(Grechet al,2000),coiled-coil結(jié)構(gòu)域的作用是自動(dòng)泛素化從而激活下游 NF-κB信號(hào)通路(Yanget al,2004)。此外,MATH結(jié)構(gòu)域能夠與通路上游信號(hào)分子IRAK相互作用(Archet al,1998)。

通過BLASTP比對(duì)表明青蛤CsTRAF6的氨基酸與櫛孔扇貝 TRAF6的同源性最高,達(dá) 60%。與霸王花青螺、蝦夷扇貝TRAF6氨基酸序列同源性為56%和 48%。通過 MEGA構(gòu)建的系統(tǒng)樹表明,不同物種的TRAF6基因各自聚成一支,青蛤CsTRAF6基因與其它軟體動(dòng)物的 CsTRAF6基因聚在一支,脊椎動(dòng)物的TRAF6基因聚在其它分支上。黑腹果蠅的TRAF6基因氨基酸序列單獨(dú)在一個(gè)分支上。結(jié)果表明,青蛤CsTRAF6基因與軟體動(dòng)物TRAF6基因進(jìn)化距離較近,相反與昆蟲以及脊椎動(dòng)物的TRAF6基因的進(jìn)化距離較遠(yuǎn),因此,CsTRAF6基因可能是TRAF6家族的一個(gè)新成員。

本研究中利用Real-time PCR方法檢測(cè)其在各個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,青蛤 CsTRAF6基因在所有的組織中普遍表達(dá),表明其參與多種生物學(xué)過程。青蛤像其它雙殼類軟體動(dòng)物一樣,有一個(gè)開放的循環(huán)系統(tǒng),其體內(nèi)的血液滲透壓和溫度會(huì)隨著環(huán)境而波動(dòng)。這個(gè)開放的血液循環(huán)體系對(duì)于無脊椎動(dòng)物的免疫防御有關(guān)鍵的作用(Bigaset al,2006)。它們可以充當(dāng)吞噬細(xì)胞以及參與體液因子的分泌。CsTRAF6基因在血淋巴中的表達(dá)量最高,這與蝦夷扇貝TRAF6的表達(dá)情況相似(Heet al,2013),這表明CsTRAF6可能在抵御病原物質(zhì)感染時(shí)發(fā)揮著重要作用。然而這與櫛孔扇貝TRAF6(CfTRAF6)基因在組織中的表達(dá)情況不同,其CfTRAF6主要在性腺中表達(dá),表明CfTRAF6基因在扇貝的發(fā)育過程中起著重要作用。上述結(jié)果表明CsTRAF6在青蛤體內(nèi)主要起到免疫作用,亦說明不同種類軟體動(dòng)物的 TRAF6基因在組織中的表達(dá)模式及調(diào)節(jié)功能有明顯差別。

前人相關(guān)研究認(rèn)為,低等動(dòng)物血液可以直接吞噬和破壞微生物(Sunet al,2001),而軟體動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)主要依靠血淋巴的循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)(Pipeet al,1997;Woottonet al,2003)。在脊椎動(dòng)物中,TLR3是通過識(shí)別雙鏈 RNA以及合成類似物如 Poly I:C,隨后引發(fā)MyD88非依賴性途徑,從而引起干擾素的分泌(Alexopoulouet al,2001)。TRAF6是Toll樣受體信號(hào)通路中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,本研究中的 CsTRAF6基因在 Poly I:C的刺激下,其表達(dá)量在侵染后的 3h便迅速升高,說明CsTRAF6基因參與了對(duì)于Poly I:C刺激的免疫應(yīng)答反應(yīng),并且青蛤內(nèi)存在于TLR3所介導(dǎo)的信號(hào)通路,有關(guān)該通路在青蛤體內(nèi)所發(fā)揮的免疫功能還需進(jìn)一步探索。

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