張珍妮　姜玥璐①　李曼璐　魏鵬驥

(1. 清華大學(xué)　深圳研究生院海洋學(xué)部　深圳　518055; 2. 清華大學(xué)　環(huán)境學(xué)院　北京　100084)

浮游植物是海洋中主要的初級生產(chǎn)者,為全球貢獻了約 40%的初級生產(chǎn)力,在海洋生態(tài)系統(tǒng)中有著不可替代的地位(Bidleet al,2004; Jianget al,2014)。浮游植物的生長和死亡,不僅受到來自細胞群體外部的海洋環(huán)境,如光、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等物理化學(xué)條件和捕食者、真菌、病毒等生物條件的影響,同時也受到種群內(nèi)彼此之間的影響(Vidoudezet al,2008; Ianoraet al,2010),使浮游植物細胞作為群體處于一種生與死的動態(tài)平衡中(Redfield,1958; Falkowskiet al,1998)。

強壯前溝藻(Amphidinium carteraeHulbert)是一種能產(chǎn)生溶血性毒素的有害赤潮藻種(冀曉青等,2012)。除了韓笑天等(2004)從生長率和細胞形態(tài)入手,對強壯前溝藻在不同環(huán)境下的生長特性進行了研究之外,國內(nèi)對不同環(huán)境條件下強壯前溝藻的生理生化過程的研究很少。盡管單一逆境條件對浮游植物生長生理變化的影響已被廣泛研究,然而,自然環(huán)境中常見的多重逆境條件(如大面積赤潮災(zāi)害引起的海水營養(yǎng)鹽匱乏,浮游植物下沉到海洋底層黑暗低溫環(huán)境,以及隨時可能遭遇的溫度突變等)對浮游植物的影響研究卻相對匱乏。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果,無法對浮游植物群落演替和海洋生態(tài)環(huán)境變化的關(guān)系進行合理的預(yù)測與控制(郭匿春,2007)。

本文希望通過研究多重逆境條件(黑暗、低溫、氮限制和磷限制)對強壯前溝藻細胞的生理、生化影響,估測其對多重逆境條件的生理生態(tài)響應(yīng)。

1　材料與方法

1.1　藻種培養(yǎng)

強壯前溝藻(CCMA-279)購自廈門大學(xué)近海海洋國家重點實驗室海洋藻類保種中心。藻種保存在f/2培養(yǎng)基無硅配方中(f/2-Si)(Guillardet al,1962),培養(yǎng)溫度為(20±1)°C,光照條件為 80μmol photon/(m2·s),光周期 L/D=14∶10。實驗用海水為經(jīng)過0.22μm 濾膜過濾的大亞灣冬季海水,鹽度為 33,海水及所用培養(yǎng)器皿均經(jīng)高壓滅菌(121°C,20min),保持實驗藻種單種培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,通過過濾空氣(4258 Acro50空氣過濾器,PALL,美國)曝氣防止培養(yǎng)基碳限制及細胞沉降的發(fā)生,并將 pH維持在8.0—8.2。

1.2　實驗條件設(shè)計

如表1所示,本次實驗設(shè)定了9種培養(yǎng)條件,包括三種物理環(huán)境: 常溫、低溫、低溫+黑暗; 以及三種營養(yǎng)條件: 營養(yǎng)充足(f/2-Si)、缺氮(f/2-Si-N)、缺磷(f/2-Si-P); 不同的物理環(huán)境結(jié)合不同的營養(yǎng)條件,得到對照組,以及單重或多重逆境條件下的實驗組。當藻細胞濃度達到對數(shù)生長末期時,在 20°C下以2500g轉(zhuǎn)速離心 15min(臺式冷凍離心機 Allegra X-15R,Beckman Coulter,美國),經(jīng)無菌海水清洗兩次后再懸浮于相應(yīng)的培養(yǎng)基中: 對照組(f/2-Si)、缺氮(f/2-Si-N)、缺磷(f/2-Si-P)。并分別放置于三種不同培養(yǎng)環(huán)境中(表 1),每個實驗條件下設(shè)三個平行樣,將開始分組實驗的當天記為第0天。

表1　實驗條件設(shè)置Tab.1　Experimental Conditions

1.3　分析方法

1.3.1藻液光密度和生長速率測定本次研究中用藻液光密度對強壯前溝藻種群的生物量(沈萍萍等,2001)進行觀測,以空白培養(yǎng)基作為對照,使用分光光度計(UV-1780,Shimadzu,日本)測試強壯前溝藻細胞在750波長下光密度(OD750),按下列公式計算其生長速率:

式中μ代表生長速率,Xt代表實驗進行到第t天時藻細胞的OD750,X0代表實驗進行到第0天時藻細胞的OD750(Sriharanet al,1990)。

1.3.2葉綠素a測定藻液經(jīng)玻璃纖維濾膜(GF/F,Whatman,英國)過濾,于-20°C 冷凍保存。葉綠素a含量(chla)經(jīng)90%丙酮低溫4°C黑暗提取16h后利用分光光度計(UV-1780,Shimadzu,日本)測定(Maxwell,1984)。

1.3.3光合作用效率測定采集后的樣品避光保存 15min,用 PHYTO-PAM(Walz,德國)測試光合系統(tǒng)II最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm),操作過程避光。

1.3.4SYTOX Green熒光染色SYTOX Green(SYTOX? Green Nucleic Acid StainS7020,Thermo Fisher,美國)作為一種細胞染料,可以對不同膜透性的細胞進行不同程度的染色,由于死亡細胞膜透性遠大于活細胞,從而可以用于死細胞鑒別(Jauzeinet al,2013; Jianget al,2014)。在藻細胞液中加入SYTOX Green染色劑(最終濃度為5×10-5mol/L),樣品置于96孔板,于室溫黑暗放置 10min后測量熒光值,激發(fā)光波長為 480nm(多功能酶標儀 SpectraMax i3x,Molecular Devices,美國)。

1.3.5碳、氮含量測定藻液用GF/F玻璃纖維濾膜(預(yù)先于 550°C 灼燒 12h)過濾收集后,于-20°C 儲存。在60°C烘干后用元素分析儀(Vario MACRO cube,Elementar,德國)測定碳、氮含量,并計算碳氮比(C/N摩爾比)。

1.4　數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析,采用2-way ANOVA Analysis(P＜0.05)對多因素逆境脅迫條件下的實驗結(jié)果進行分析,檢測單一及兩種耦合逆境條件對藻細胞生理生化變化的影響,找出顯著影響因素并檢測兩因素之間是否存在顯著相關(guān)效應(yīng)。

2　結(jié)果與分析

2.1　多重逆境條件對強壯前溝藻生長的影響

從圖 1可見,低溫組的 OD750下降最為明顯,在第5天,營養(yǎng)充足(CL)、氮限制(CL-N)和磷限制實驗組 (CL-P)分 別 下 降 至 (0.17±0.03)、 (0.17±0.01)和(0.21±0.02),而此時常溫光照和低溫黑暗環(huán)境中這三種營養(yǎng)條件下的 OD750分別是低溫組的 1.4—3倍和1.4—1.8倍。

通過Two-way ANOVA分析顯示(表2所示),單獨低溫逆境并沒有對OD750造成顯著性影響(P=0.316),而營養(yǎng)限制條件(缺氮、缺磷)(P＜0.05)、黑暗條件(P＜0.001)以及低溫和營養(yǎng)限制兩種逆境條件同時發(fā)生時(P＜0.01)對OD750有顯著影響。

強壯前溝藻在常溫條件下,營養(yǎng)充足和磷限制時,生長速率分別為(0.01±0.02)和(0.02±0.02)/天,而其它逆境實驗組(CON-N、CL、CL-N、CL-P、CD、CD-N、CD-P)的生長速率皆為負值。常溫氮限制條件(CON-N)下細胞生長速率為(-0.06±0.01); 低溫組的三種營養(yǎng)鹽條件下細胞生長速率分別為(-0.19±0.06)/天 (CL)、 (-0.17±0.02)/天 (CL-N)和 (-0.12±0.02)/天(CL-P); 低溫黑暗組三種營養(yǎng)鹽條件下細胞生長速率分別為(-0.07±0.00)/天(CD)、(-0.08±0.01)/天(CD-N)和(-0.05±0.00)/天(CD-P)(表 3)。

圖1　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻OD750值的影響Fig.1　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on the OD750 of Amphidiniumcarterae

表2　營養(yǎng)、低溫和黑暗條件對強壯前溝藻生長和生理生化影響的Two-way ANOVA分析Tab. 2　Two-way ANOVA analysis on the effect of nutrients,low temperature and darkness on the growth and physiological and biochemical changes of Amphidinium carterae

2.2　多重逆境條件對強壯前溝藻葉綠素和光合作用效率的影響

低溫黑暗環(huán)境下強壯前溝藻的chla濃度高于其它常溫組及低溫組,在第 11天,三種營養(yǎng)條件下chla濃度分別為(109.03±5.43)μg/L(CD)、(155.97±8.43)μg/L(CD-N)和(213.90±18.09)μg/L(CD-P)。而低溫光照環(huán)境下強壯前溝藻的 chla持續(xù)下降,不論營養(yǎng)條件如何chla五天內(nèi)全部下降至10μg/L以下(圖2)。根據(jù)Two-way ANOVA分析(表2),黑暗對chla的濃度產(chǎn)生顯著性影響(P＜0.001),而營養(yǎng)限制條件、低溫,以及低溫和營養(yǎng)限制條件、黑暗和營養(yǎng)限制條件一同發(fā)生,對chla濃度無顯著性影響(P值均＞0.05)。

表3　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件下強壯前溝藻的生長速率Tab. 3　Growth Rate of Amphidinium carterae in normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD)

圖2　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻chl a值的影響Fig.2　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on the Chla of Amphidinium carterae

圖3　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻Fv/Fm值的影響Fig.3　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on the Fv/Fm of Amphidinium carterae

營養(yǎng)充足條件下常溫組(CON)Fv/Fm值最高,經(jīng)過短暫的較低水平后,第 3天升高為(0.53±0.02)后較為穩(wěn)定。常溫光照條件下的氮限制(CON-N)和磷限制(CON-P)實驗組Fv/Fm值僅次于對照組,低溫黑暗條件中強壯前溝藻的Fv/Fm雖然最終低于對照組,但呈現(xiàn)緩慢上升趨勢且較為穩(wěn)定。而低溫光照條件下實驗組的Fv/Fm最低。Two-way ANOVA分析表明(表2),單一低溫條件或黑暗條件會對Fv/Fm產(chǎn)生顯著性影響(P＜0.001),而其它逆境條件不會對Fv/Fm有顯著性影響(P值均＞0.05)。

2.3　SYTOX Green染色結(jié)果

低溫黑暗條件下營養(yǎng)充足、氮限制和磷限制實驗組的SYTOX Green值最低,即死亡藻細胞較少。而低溫光照條件下的SYTOX Green值要高于其它條件下的實驗組,即死亡藻細胞較多。單一低溫、黑暗環(huán)境條件對 SYTOX Green染色結(jié)果有顯著性影響(P＜0.001,見表 2)。

2.4　多重逆境條件對強壯前溝藻顆粒碳含量和氮含量的影響

常溫光照環(huán)境下的實驗組顆粒有機碳(particulate organic carbon,POC)、顆粒有機氮(particulate organic nitrogen,PON)較高,而在低溫環(huán)境中無論是有光照還是黑暗環(huán)境,POC都有所下降。與其它實驗組相比,低溫黑暗環(huán)境實驗組的POC、低溫光照環(huán)境實驗組的PON降低最為明顯。而從C/N摩爾比來看,無論營養(yǎng)條件如何,低溫黑暗實驗組的C/N比最低。營養(yǎng)條件以及營養(yǎng)和低溫耦合條件會對 C/N產(chǎn)生顯著性影響(P＜0.05)(表 2)。

圖4　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻SYTOX Green染色(取對數(shù)值)的影響Fig.4　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on the SYTOX Green staining(logarithmic value) of Amphidinium carterae

圖5　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻POC的影響Fig.5　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on POC of Amphidinium carterae

圖6　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻PON的影響Fig.6　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on PON of Amphidinium carterae

3　討論

3.1　強壯前溝藻在多重逆境條件下的生長和生理響應(yīng)

圖7　常溫(CON)、低溫(CL)和低溫黑暗(CD)條件對強壯前溝藻C/N比的影響Fig.7　The effect of normal condition (CON),low temperature (CL) and cold dark environment (CD) on C/N of Amphidinium cartera

相對于營養(yǎng)匱乏,本研究數(shù)據(jù)顯示低溫和黑暗逆境條件會對強壯前溝藻的生長、生理產(chǎn)生更加不利的影響,且這兩種條件在多重逆境下是主導(dǎo)的關(guān)鍵性因素,其中,10°C低溫對強壯前溝藻的不利影響最為顯著。本研究結(jié)果表明,單獨低溫逆境下,強壯前溝藻SYTOX Green熒光染色增強,表明藻細胞死亡加劇,同時Fv/Fm快速下降,其光合活性迅速降低。其內(nèi)在原因為低溫脅迫可同時作用于藻細胞的基因表達、功能蛋白合成、多糖合成等多個過程,可干擾光合作用并影響細胞的固氮能力,當溫度低于藻細胞的耐受溫度時,則會引起細胞死亡(貢保東珠,2011;王海燕,2011)。除低溫條件外,黑暗作為單獨逆境因素也具有致死性,如Bidle等(2004)的研究表明,長時間的黑暗能誘發(fā)浮游植物的細胞程序性死亡過程。從本研究看,黑暗逆境對強壯前溝藻的OD750、chla、Fv/Fm、SYTOX Green染色結(jié)果產(chǎn)生了顯著性影響(P＜0.001,如表 2 所示)。

當黑暗和低溫逆境條件耦合時,強壯前溝藻的細胞死亡過程反而得以緩解,其具體表現(xiàn)為在低溫黑暗環(huán)境中藻細胞SYTOX Green染色強度處于較低水平,chla穩(wěn)定,Fv/Fm有所上升。據(jù)此,進一步推斷藻細胞可能處于一種“休眠”狀態(tài),細胞內(nèi)光合效率大幅度減弱的同時胞內(nèi)酶活性降低,呼吸作用得到抑制,新陳代謝與物質(zhì)損耗變慢,從而可以幫助藻細胞保存實力,在營養(yǎng)條件和光照狀況好轉(zhuǎn)時快速恢復(fù)生長。這一推斷在前人的研究中也得到了印證,Montechiaro等(2006)將此稱為微藻生物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)策略(homeostatic responses),即在極端環(huán)境下浮游植物會通過降低代謝和抑制生長繁殖來增大存活幾率。魏靜等(2013)研究發(fā)現(xiàn),低溫黑暗環(huán)境可暫時抑制南極衣藻(Chlamydomonassp.)細胞的生長,并降低細胞運動速率,同時衣藻細胞的光合作用能力得到保護,POC含量保持穩(wěn)定。Peters等(1996)也發(fā)現(xiàn)了黑暗低溫環(huán)境下四種硅藻的內(nèi)穩(wěn)態(tài)策略。本次實驗的結(jié)果顯示,強壯前溝藻作為非極地藻亦可借助“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”策略在低溫黑暗環(huán)境下提高其生存概率。

營養(yǎng)限制和低溫逆境條件耦合會對強壯前溝藻細胞內(nèi)直接與物質(zhì)代謝相關(guān)的生理生化指標(生物量OD750和碳氮比C/N)產(chǎn)生顯著性影響(P＜0.01,見表2),這點與營養(yǎng)限制或低溫逆境單獨作用下強壯前溝藻的生理生化表現(xiàn)有所不同。單獨營養(yǎng)限制下,OD750和 C/N 也會受到顯著性影響(P＜0.05,見表 2),但其顯著性低于營養(yǎng)限制與低溫并存的雙重逆境條件。而單獨低溫條件下,強壯前溝藻的 SYTOX Green和Fv/Fm受影響顯著(P＜0.001,見表2)。營養(yǎng)限制與低溫逆境并同發(fā)生時,彼此產(chǎn)生了耦合效應(yīng),其效果不再是兩個逆境因素單獨作用于強壯前溝藻時生理生化反應(yīng)的疊加。

3.2　多重逆境條件對強壯前溝藻種群的影響

從種群的角度出發(fā),逆境條件的致死性是相對的。低溫、黑暗和營養(yǎng)匱乏等逆境條件可以使單個藻細胞致死,但對細胞群體卻不盡然,這與前人的研究結(jié)果一致(Bergeset al,1998)。從實驗結(jié)果來看,SYTOX Green染色增強,由此可知藻細胞作為個體死亡增加,然而多數(shù)情況下,存活的少數(shù)藻細胞反而可以借助死亡細胞所釋放的營養(yǎng)物質(zhì)和空間優(yōu)勢,在環(huán)境轉(zhuǎn)好時快速生長繁殖(Redfieldet al,1958;Falkowskiet al,1998)。從“紅皇后假說”(the red queen hypothesis)的理論出發(fā),細胞死亡可被視為浮游植物種群調(diào)控個體數(shù)量的一種方式,在群體遭遇逆境環(huán)境時,部分細胞的“無私死亡”增大了群體存活的概率(Franklinet al,2006)。對于該現(xiàn)象,藻細胞除了因逆境導(dǎo)致“被動”死亡并釋放營養(yǎng)物質(zhì)以供存活細胞利用外,還可能存在一定的“主動”傾向,即其可能借助激素、化學(xué)物質(zhì)等方式通過化感作用調(diào)節(jié)種間與種內(nèi)關(guān)系(Huet al,2008; Vidoudezet al,2008; Ianoraet al,2010)。

4　結(jié)語

綜上所述,從單個浮游植物細胞的層面來看,藻細胞內(nèi)部的光合作用、新陳代謝、程序性死亡等過程相互影響,彼此關(guān)聯(lián),在海洋微藻生理生化研究中應(yīng)給予其更全面的考慮。從赤潮預(yù)估的角度來看,雖然氮、磷營養(yǎng)限制確實會對浮游植物的生理代謝、生長繁殖產(chǎn)生影響,如干擾細胞的生物量和有機碳氮比,但從本次實驗結(jié)果中看,其影響遠不及低溫和黑暗逆境條件。赤潮發(fā)生時,營養(yǎng)鹽限制并非浮游植物種群消亡、群落演替的唯一限制性因素,低溫和黑暗條件對多個生理生化指標也可產(chǎn)生顯著影響。溫度變化會導(dǎo)致浮游植物的突發(fā)性增殖,影響浮游植物的群落結(jié)構(gòu)與年際變化(Agawinet al,2000; Zinseret al,2007),而受天氣影響的光照變化會導(dǎo)致短時間內(nèi)群落結(jié)構(gòu)改變和赤潮發(fā)生。根據(jù)往年觀測,東海春季暴發(fā)大規(guī)模夜光藻(Noctiluca scientillans)、東海原甲藻(Prorocentrum micans)赤潮時大多是連日陰雨多云天氣,而夏秋季節(jié)爆發(fā)中肋骨條藻(Skeletonema costatum)赤潮時大多以晴天為主(孫霞,2005)。在海洋環(huán)境中,天氣變化、洋流運動、氣流交鋒等時有發(fā)生,光照溫度條件隨之變化,進而影響赤潮的發(fā)展動態(tài),對赤潮預(yù)測具有重要的參考價值。

致謝感謝陳道毅老師以及廈門大學(xué)藻種庫對本次研究的支持。

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