徐成勛　李　琪　張景曉　孔令鋒

(中國海洋大學　海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室　青島　266003)

近交(inbreeding)是指有親緣關系的個體通過相互交配,使一個群體內純合基因型增加的現(xiàn)象(Kelleret al,2002)。隨著人們對水產品的需求量逐漸增大,水產品的人工捕撈量逐年增加,依靠人工養(yǎng)殖來替代部分人工捕撈以滿足需求漸漸成為趨勢。水產動物養(yǎng)殖苗種的親本大多來源于養(yǎng)殖群體,由于水產動物產卵量大,育苗生產中使用的親本數(shù)量往往有限,因而養(yǎng)殖群體內近交的發(fā)生是不可避免的。近交常常會造成物種的某些性狀衰退,這種效應被稱為近交衰退(inbreeding depression)。相比于形態(tài)學性狀,與適應性相關的綜合性狀更容易表現(xiàn)出近交衰退(馬大勇等,2005),如生存能力、繁殖能力和競爭能力等。目前對水產動物近交衰退的研究主要針對魚類,如團頭魴(Megalobrama amblycephala)(Liet al,2003),銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)(Myerset al,2001;Gallardoet al,2004),大西洋鮭(Salom salar)(Ryeet al,1998)等,研究的焦點主要集中在魚類的生長、存活和性腺發(fā)育程度等相關性狀的近交衰退上。針對海產貝類,國內外學者圍繞貝類幼蟲、稚貝和成體的生長與存活等方面開展了近交衰退的影響研究(Beattieet al,1987; 張海濱,2005; Zhenget al,2012; 梁健等,2013;傅強等,2015)。

長牡蠣(Crassostrea gigas),又稱太平洋牡蠣,具有生長快、適應性強、肉質細膩和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點,是世界性的牡蠣養(yǎng)殖種。自20世紀80年代以來,我國長牡蠣的人工養(yǎng)殖技術得到快速發(fā)展,經過長時間的探索和完善后已經相對成熟,長牡蠣的養(yǎng)殖量也逐年攀升。2014年我國牡蠣養(yǎng)殖總產量超過 435萬噸,占全國貝類養(yǎng)殖總產量的 33.1%(農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局,2015)。雖然目前統(tǒng)計資料沒有區(qū)分養(yǎng)殖牡蠣的具體種類,但據(jù)估計長牡蠣的養(yǎng)殖產量應占總量的1/3左右(于瑞海等,2008)。近年來,隨著長牡蠣養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大,產量不斷提高,長牡蠣養(yǎng)殖也出現(xiàn)了種質退化現(xiàn)象。為了維護長牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展,國內學者先后對長牡蠣展開了遺傳育種的研究工作,針對殼形,殼色,生長存活等性狀方面的遺傳改良工作已取得一定進展(王慶志,2011; 王慶志等,2013; 叢日浩,2014),并培育出殼色為金色的殼金長牡蠣新品系(叢日浩等,2014; 葛建龍等,2015)。

為探討近交對殼金長牡蠣生長和存活性狀的影響,本研究以殼金長牡蠣品系為材料,通過構建近交家系,研究了近交對殼金長牡蠣家系幼蟲期與稚貝期生長和存活的影響,以期為殼金長牡蠣的進一步培育工作提供依據(jù)和參考。

1　材料和方法

1.1　親貝來源及實驗設計

實驗用親貝來自于2014年以第四代殼金長牡蠣群體構建的全同胞殼金長牡蠣家系 G19(近交系數(shù)Fx=0.25)。從殼金長牡蠣家系 G19一齡貝中,挑選殼色性狀優(yōu)良、殼型規(guī)則、外表無損傷的雌雄成貝各10個,通過進行單對兄妹交配獲得 10個全同胞 F1家系。同時從山東省乳山長牡蠣野生群體中選取殼型規(guī)則、外表無損傷的個體雌雄成貝各 10個,逐一單對交配獲得10個全同胞家系作為對照組。實驗在山東省萊州市海益苗業(yè)有限公司的育苗基地進行。

1.2　親貝促熟和人工授精孵化

2015年 5月將從乳山采集的親貝運往萊州市海益苗業(yè)有限公司的育苗基地進行室內暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和小新月菱形藻(Nitzschia closterium)進行人工育肥。挑選性腺發(fā)育良好的親貝,進行人工解剖授精。剖開牡蠣,挑取少量性腺組織于載玻片上辨別雌雄,呈煙霧狀為雄性,呈顆粒狀散開則為雌性。雌雄各辨別出 10個,分別利用250目和300目篩絹獲取卵子和精子。將10個雌性親貝的卵子分別置于盛有海水10個15L桶中,水溫保持為25°C。卵子經過15min熟化后,將10個雄性親貝的精子分別與之逐一充分混合。各組孵化密度為每毫升 50—70個卵,孵化期間微充氣。各家系的實驗器具單獨使用,避免污染。各家系的建立均在 1天內完成。

1.3　選優(yōu)和幼蟲培育

經過22h孵化,受精卵發(fā)育成D形幼蟲。選優(yōu)前,停止充氣15min。用350目的篩絹網進行選優(yōu),將選出的幼蟲置于 100L聚乙烯塑料桶中進行培育,調節(jié)培育密度為 5ind./mL。培育溫度為 24—26°C。持續(xù)充氣,每日換水2次,每次換水量為原體積的1/3。每日投餌4次,培育前期投喂球等鞭金藻,后期補充投喂扁藻(Platymonassp.)。充氣、換水和投餌等一系列操作保持一致,并且每次使用實驗器具后用淡水進行沖洗,防止家系間的污染。

1.4　采苗和稚貝養(yǎng)成

幼蟲發(fā)育 20天后,出現(xiàn)眼點。眼點幼蟲達總數(shù)1/3時,投放櫛孔扇貝殼作為附著基。室內附著10天后,將附著好的附著基放入室外暫養(yǎng)池暫養(yǎng)30天后,轉移到榮成俚島鎮(zhèn)海區(qū)進行稚貝的浮筏暫養(yǎng)。待自然海區(qū)無野生牡蠣浮游幼蟲時,轉至乳山海陽所鎮(zhèn)海區(qū)進行籠式浮筏稚貝養(yǎng)成。實驗組與對照組的養(yǎng)殖密度、水層深度均保持一致。

1.5　數(shù)據(jù)測量和分析

分別測量殼金F1家系和對照組長牡蠣1、5、10、15、20、85、130、190日齡的殼高、殼長和存活率,每組隨機測量30個個體。將D形幼蟲放在顯微鏡下測量,稚貝用游標卡尺測量。幼蟲存活率為單位體積內幼蟲數(shù)與初始幼蟲數(shù)的百分比,稚貝存活率為不同日齡存活稚貝個數(shù)與初始稚貝個數(shù)的百分比。

殼金F1家系各日齡的殼高、殼長和存活的近交衰退率的計算公式如下(Crnokraket al,1999; Zhenget al,2008):

式中,Sx為殼金F1家系的殼高、殼長或存活率,Px為對照組殼高、殼長或存活率。

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANVOA),并進行T檢驗(T–test)顯著性檢驗,顯著性設置為α=0.05。

2　結果

2.1　殼金F1家系在幼蟲和稚貝期殼高的變化及近交衰退

殼金F1家系和對照組幼蟲期的殼高變化和近交衰退率如表1所示。方差分析和T檢驗結果表明,殼金 F1家系殼高在幼蟲期的生長速度(9.57μm/d)低于對照組(11.04μm/d),且兩者之間的差異僅在1日齡時不顯著(P＞0.05)。在1日齡至10日齡間,殼金F1家系殼高的近交衰退率呈遞增的趨勢,在 10日齡時達到最大,為13.70%,之后穩(wěn)定在11%左右。

殼金 F1家系和對照組稚貝期的殼高變化和近交衰退率如表2所示。在稚貝期,殼金F1家系的殼高仍小于對照組,但兩者的差異在逐漸減小,在85日齡和130日齡時差異顯著(P＜0.05),在190日齡時差異不顯著(P＞0.05)。殼金F1家系殼高的近交衰退率在稚貝期呈遞減趨勢,在190日齡時達到最低,為6.16%。

表1　殼金F1家系和對照組幼蟲期的平均殼高與生長速度和近交衰退率Tab.1　Comparison in average height,growth rate,and inbreeding depression rate of larval shell between golden shell F1 and the control families

表2　殼金F1家系和對照組稚貝期的平均殼長、殼高和近交衰退率Tab.2　Comparison in average length,growth rate,and inbreeding depression rate of spat shell between golden shell F1 and the control families

2.2　殼金F1家系在幼蟲和稚貝期殼長的變化及近交衰退

殼金F1家系和對照組幼蟲期的殼長變化和近交衰退率如表 3所示。在幼蟲期,與殼高的變化相似,殼金 F1家系殼長的生長速度(7.67μm/d)也低于對照組(8.32μm/d),兩者殼長的差異僅在 1日齡差異不顯著(P＞0.05)。在1日齡至10日齡間,殼金F1家系殼長的近交衰退率呈遞增的趨勢,在 10日齡時達到最大,為10.83%,之后穩(wěn)定在6%左右。

殼金F1家系和對照組稚貝期的殼長變化和近交衰退率如表2所示。在稚貝期,殼金 F1家系的殼長仍小于對照組,但兩者的差異在逐漸減小,在 85日齡和130日齡時差異顯著(P＜0.05),在190日齡時差異不顯著(P＞0.05)。殼金F1家系殼長的近交衰退率在稚貝期呈遞減趨勢,在 190日齡時達到最低,為1.76%。

表3　殼金F1家系和對照組幼蟲期的平均殼長、生長速度及近交衰退率Tab.3　Comparison in average length,growth rate,and inbreeding depression rate of larval shell between golden shell F1 and the control families

2.3　殼金F1家系在幼蟲期和稚貝期的存活率及近交衰退率

殼金F1家系和對照組在幼蟲期和稚貝期的存活率及近交衰退率如表4、表5所示。在幼蟲期各日齡,殼金 F1家系的存活率均低于對照組,且兩者之間的差異僅在20日齡時顯著(P＜0.05)。殼金F1家系的近交衰退率也隨時間的增加而增加,在 20日齡時達到最大,為27.44%。

表4　殼金F1家系和對照組幼蟲期的存活率(%)及近交衰退率(%)Tab.4　Comparison in survival rate(%),inbreeding depression rate(%) of larval between golden shell F1 and the control families

在稚貝期,殼金 F1家系的存活率依舊低于對照組。但兩者之間的差異并不顯著(P＞0.05)。其存活的近交衰退率沒有明顯的變化趨勢,穩(wěn)定在3%左右。

表5　殼金F1家系和對照組稚貝期的存活率(%)及近交衰退率(%)Tab.5　Comparison in survival rate (%) and inbreeding depression rate (%) of spat between golden shell F1 and the control families

3　討論

通常情況下,近交會使物種的所有性狀都衰退,但不同性狀受到近交衰退的影響并不完全相同。一般來說,近交更傾向于使一些與生物適應度密切相關的性狀出現(xiàn)衰退(Charlesworthet al,2009)。在本研究中,殼金長牡蠣的殼高、殼長和存活率在幼蟲期與稚貝期均發(fā)生了一定程度的近交衰退。與生長相關的殼高和殼長在大部分情況下與對照組差異明顯,而存活率與對照組的差異卻不顯著(P＞0.05)。這與Beattie等對長牡蠣全同胞家系后代研究發(fā)現(xiàn)殼大小和肉重等都有顯著衰退(Beattieet al,1987),及Lannan研究發(fā)現(xiàn)長牡蠣全同胞家系后代存活率沒有衰退的結果相似(Lannan,1980)。這說明相對于存活,與生長相關的殼高、殼長等指標更容易受到近交衰退的影響。越來越多的學者支持產生近交衰退的“顯性假說”(Cheptouet al,2000; Zhenget al,2008),即近交使在雜合狀態(tài)下不表達的隱性有害等位基因純合,這種隱性有害等位基因表達后容易被淘汰,從而導致相關表型性狀的衰退。本研究中殼高和殼長與存活率相比更容易受到影響,可能是由于控制殼高和殼長的基因在殼金 F1家系中有較高的雜合度,因此在近交時更容易使隱性有害等位基因純合,導致產生相對較小的個體。

幼蟲期,殼金 F1家系殼高和殼長的生長都慢于對照組,但二者之間的差異僅在 1日齡時不顯著(P＞0.05),其原因可能與母性效應有關。Cruz在對扇貝雜交的研究中也觀察到類似現(xiàn)象(Cruzet al,1997)。幼蟲期,殼金 F1家系的存活率普遍低于對照組,但僅在 20日齡時其存活率與對照組差異顯著(P＜0.05),這可能與環(huán)境脅迫對幼蟲變態(tài)發(fā)育的影響有關。20日齡左右,幼蟲開始出現(xiàn)眼點,正值附著變態(tài)的關鍵時期,對環(huán)境的變化相對敏感,環(huán)境因子的波動可能會導致遺傳基礎薄弱的個體死亡。因此可以推測,控制長牡蠣附著變態(tài)的基因在殼金長牡蠣品系的群體中雜合度相對較高,近交時容易使隱性有害等位基因純合,從而造成附著變態(tài)期的高死亡率。

在本研究中,稚貝期殼金 F1家系殼高和殼長雖慢于對照組,但二者的差異在逐漸縮小,至190日齡時,殼金 F1家系殼高和殼長與對照組無顯著差異(P＞0.05)。這可能與環(huán)境脅迫有關,稚貝初期,幼蟲經過附著變態(tài),從室內人工培育移至室外暫養(yǎng),室內外的不同環(huán)境因子可能會對殼金長牡蠣發(fā)生脅迫。Armbruster等(2005)認為環(huán)境脅迫會加劇近交衰退的程度,從而導致稚貝初期殼金長牡蠣殼高和殼長的低生長率。稚貝期殼金F1家系的存活率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05),這說明近交對殼金F1家系稚貝期存活的影響不大,與張景曉等(2014)對長牡蠣近交研究的結果類似。

4　結論

品系的穩(wěn)定性和適應性是遺傳改良的重要目標(張國范等,2006)。在遺傳育種時,不僅要考慮通過近交使優(yōu)良的性狀得到純化,還要考慮如何避免近交給其它性狀帶來的衰退效應。本研究中,雖然殼金長牡蠣家系近交所產生后代的殼色性狀得到了保留和純化,但在殼高、殼長與存活率方面都發(fā)生了一定程度的衰退。因此,在長牡蠣遺傳育種工作中,不能一味通過增加近交代數(shù)來獲得純系,還應該結合選擇育種、雜交育種、分子輔助育種等多種手段來優(yōu)化選育進程,這樣才能培育出優(yōu)良的長牡蠣新品種。

于瑞海,李琪,王昭萍等,2008. 我國北方太平洋牡蠣育苗及養(yǎng)殖現(xiàn)狀. 科學養(yǎng)魚,(6): 3—5

馬大勇,胡紅浪,孔杰,2005. 近交及其對水產養(yǎng)殖的影響.水產學報,29(6): 849—856

王慶志,2011. 長牡蠣品種選育與生長性狀的遺傳參數(shù)估計.青島: 中國海洋大學博士學位論文,113—119.

王慶志,李琪,孔令鋒等,2013. 長牡蠣第三代選育群體生長性狀的選擇效應. 水產學報,37(10): 1487—1494

叢日浩,2014. 長牡蠣快速生長品系選育及重要功能基因與生長和糖原含量相關性研究. 青島: 中國海洋大學博士學位論文,67—77

叢日浩,李琪,葛建龍等,2014. 長牡蠣 4種殼色家系子代的表型性狀比較. 中國水產科學,21(3): 494—502

農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局,2015. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒. 北京: 中國農業(yè)出版社,23—29

張國范,劉曉,2006. 關于貝類遺傳改良幾個問題的討論.水產學報,30(1): 130—137

張海濱,2005. 海灣扇貝近交生物學效應和遺傳改良研究. 青島: 中國科學院研究生院(海洋研究所)博士學位論文.

張景曉,李琪,葛建龍等,2014. 近交對長牡蠣幼蟲和稚貝生長與存活的影響. 水產學報,38(12): 2005—2011

梁健,閆喜武,霍忠明等,2013. 不同近交系數(shù)蛤仔橙色品系的生長和成活研究. 南方水產科學,9(4): 87—93

葛建龍,李琪,于紅等,2015. 長牡蠣 3種殼色家系間雜交子代生長和存活比較. 水產學報,39(3): 345—352

傅強,王師,趙亮等,2015. 不同近交系數(shù)的蝦夷扇貝近交衰退研究. 中國海洋大學學報,45(11): 43—48

Armbruster P,Reed D H,2005. Inbreeding depression in benign and stressful environments. Heredity,95(3): 235—242

Beattie J,Perdue J,Hershberger Wet al,1987. Effects of inbreeding on growth in the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Journal of Shellfish Research,6(1): 25—28

Charlesworth D,Willis J H,2009. The genetics of inbreeding depression. Nature Reviews Genetics,10(11): 783—796

Cheptou P O,Berger A,Blanchard Aet al,2000. The effect of drought stress on inbreeding depression in four populations of the Mediterranean outcrossing plantCrepis sancta(Asteraceae). Heredity,85(3): 294—302

Crnokrak P,Roff D A,1999. Inbreeding depression in the wild.Heredity,83(3): 260—270

Cruz P,Ibarra A M,1997. Larval growth and survival of two catarina scallop (Argopecten circularis,Sowerby,1835)populations and their reciprocal crosses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,212(1): 95—110

Gallardo J A,Garci?a X,Lhorente J Pet al,2004. Inbreeding and inbreeding depression of female reproductive traits in two populations of Coho salmon selected using BLUP predictors of breeding values. Aquaculture,234(1—4): 111—122

Keller L F,Waller D M,2002. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution,17(5):230—241

Lannan J E,1980. Broodstock management ofCrassostrea gigas:I. Genetic and environmental variation in survival in the larval rearing system. Aquaculture,21(4): 323—336

Li S F,Cai W Q,2003. Genetic improvement of the herbivorous blunt snout bream (Megalobrama amblycephala). Naga,26(1): 20—23

Myers J M,Heggelund P O,Hudson Get al,2001. Genetics and broodstock management of coho salmon. Aquaculture,197(1—4): 43—62

Rye M,Mao I L,1998. Nonadditive genetic effects and inbreeding depression for body weight in Atlantic salmon(Salmo salarL.). Livestock Production Science,57(1):15—22

Zheng H P,Li L,Zhang G F,2012. Inbreeding depression for fitness-related traits and purging the genetic load in the hermaphroditic bay scallopArgopecten irradians irradians(Mollusca: Bivalvia). Aquaculture,366—367: 27—33

Zheng H P,Zhang G F,Guo X Met al,2008. Inbreeding depression for various traits in two cultured populations of the American bay scallop,Argopecten irradians irradiansLamarck (1819) introduced into China. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,364(1): 42—47