蒲忠慧，王保山，陳希文，王雄清，鄧思霞，周小琴（.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽6000；.北京生泰爾生物科技有限公司，北京大興0600）

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功勞葉提取物的體外抗菌活性研究

蒲忠慧，王保山2，陳希文1，王雄清1，鄧思霞1，周小琴1
（1.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽621000；2.北京生泰爾生物科技有限公司，北京大興102600）

摘要：采用水提法和乙醇回流加熱法分別提取功勞葉，應(yīng)用牛津杯法和試管二倍稀釋法分別檢測(cè)功勞葉提取物對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑、最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Consistency，MIC）和最低殺菌濃度（Minimum Bactericidal Consistency，MBC）。結(jié)果顯示，功勞葉醇提物金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為20.69 mm、15.40 mm；MIC值分別是31.3 mg/mL、125 mg/mL；MBC值分別是62.5 mg/mL、＞500 mg/mL。功勞葉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈13.54 mm，其MIC值、MBC值分別是62.5 mg/mL、500 mg/mL，對(duì)大腸桿菌抗菌活性較弱，其MIC值為500 mg/mL，MBC＞500 mg/ mL。功勞葉不同提取物對(duì)細(xì)菌的抗菌活性有所差異，功勞葉醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均由不同程度的抑菌或殺菌能力。

關(guān)鍵詞：功勞葉；抗菌活性；MIC；MBC

十大功勞（Mahonia japonica）屬于小檗科（Ber?beridaceae）十大功勞屬（Mahonia），該屬植物為多年生小灌木[1]，資源豐富，產(chǎn)量多，在我國民間藥用已久，以根、莖入藥的稱為功勞木，以葉入藥的稱為功勞葉?，F(xiàn)代藥理研究證明，功勞葉具有抗菌[2]、消炎[3]、抗癌[4-5]、抗病毒、抗心率失常、抗血小板聚集以及清熱燥濕、瀉火解毒的功效[1]。其主要活性成分為小檗堿[6]，又稱黃連素，臨床上用于細(xì)菌性痢疾、傷寒、肺結(jié)核、急性扁桃體炎等癥。

近年來，關(guān)于十大功勞屬植物主要集中于其化學(xué)成分進(jìn)行的研究，雖有功勞在抗病原微生物的初步應(yīng)用探索[3，7]，但對(duì)畜禽細(xì)菌性疾病的主要致病菌的抑制作用報(bào)道較少。基于此，本研究擬選用當(dāng)?shù)厣L的功勞葉，采用水提法與醇提法分別對(duì)豬源的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，旨為在畜禽疾病防治中充分利用當(dāng)?shù)刭Y源和進(jìn)一步開發(fā)植物藥提供了新的途徑。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基致病菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由綿陽師范學(xué)院生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心從綿陽市某豬場患病豬的病料中分離所得。

MH肉湯培養(yǎng)基（Mueller-Hintonbroth），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130726；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nutrienta agar），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130702。

1.2中藥功勞葉（產(chǎn)地四川，批次130350），購自成都中藥材市場。按照《中華人民共和國獸藥典》（2010年版二部）十大功勞屬項(xiàng)下鑒定合格。

1.3器材旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R502B（上海亞榮生化儀器廠）；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DNP-9052BS—Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SYC-C電熱恒溫調(diào)速振蕩器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；牛津杯內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。

1.4功勞葉粗提物的制備將功勞葉粉碎后過20目篩，分別用95%乙醇回流提取、水煎煮。料液比1∶12，每種溶劑重復(fù)提取3次，時(shí)間分別為3 h、2 h、1 h。將每種溶劑3次所得濾液減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL，真空干燥至恒重，精密稱量，計(jì)算浸膏得率。

1.5體外抑菌試驗(yàn)

1.5.1菌懸液的制備將供試菌種接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)挑取活化后的單個(gè)菌落接種于新鮮的MH肉湯培養(yǎng)基中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h作為原菌液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，用無菌生理鹽水將受試菌株調(diào)至1×106～107CFU/mL，備用[8]。

1.5.2牛津杯法測(cè)定抑菌活性采用牛津杯法測(cè)定抑菌活性[9]。用微量移液器吸取0.2 mL菌液于制備好的營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中，用無菌玻璃耙涂布均勻，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中。在水平放置的平皿中均勻地放置4個(gè)牛津杯，其中3個(gè)各加入同種藥液50 μL，另外1個(gè)加入相應(yīng)的溶劑作陰性對(duì)照。隨后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移去牛津杯，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑（按十字交叉法測(cè)量菌落直徑2次，取其平均值）。

抑菌效果判定[10]：抑菌圈直徑＞20 mm為極敏感；在15～20 mm為高度敏感；在10～15 mm之間為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感。

1.5.3最小抑菌濃度的測(cè)定采用試管二倍稀釋法[11-12]。取已滅菌且編號(hào)試管9支，先在1～8號(hào)試管加MH肉湯2 mL，然后吸取功勞葉提取物（濃度為1 g/mL）2 mL移入1號(hào)試管，充分混勻后倍半稀釋，向上述每管加菌懸液50 μL，同時(shí)設(shè)MH對(duì)照管、菌液對(duì)照管，使每管中的藥物濃度分別為500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.3 mg/mL、15.6 mg/mL、7.8 mg/mL、3.9 mg/mL。每管3個(gè)重復(fù)，置37℃置搖床（150 r/min）培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察試管內(nèi)液體澄清的最低藥物濃度記為最低抑菌濃度（MIC）。

1.5.4最小殺菌濃度的測(cè)定在MIC結(jié)果的基礎(chǔ)上，從肉眼可見無渾濁的試管中吸取50 μL液體涂布于營養(yǎng)瓊脂固體平板上[13]，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，以殺滅99.9%細(xì)菌數(shù)量的最低濃度或者培養(yǎng)板上無菌落生長的最低濃度記為MBC。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1功勞葉粗提物的抑菌活性比較采用牛津杯法分別測(cè)定了功勞葉水提物、醇提物在2 g/mL的生藥濃度下為對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抑菌活性，結(jié)果見表1及前插彩版圖1～3。由表1可知：與陰性對(duì)照相比：功勞葉醇提物對(duì)2種供試菌具有不同程度的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為20.69 mm；呈極敏性，對(duì)大腸桿菌（15.40 mm）表現(xiàn)出高敏性；功勞葉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果相對(duì)較好，抑菌圈直徑為13.54 mm表現(xiàn)出中敏性，對(duì)大腸桿菌抑菌直徑＜10 mm為低度敏感。以上結(jié)果說明了功勞葉醇提物抑菌效果優(yōu)于水提物，從提取得率來看，水提物得率（16.64%）略高于醇提物（13.58%）。

表1　功勞葉提取物對(duì)供試菌的體外抑菌活性

2.2最低抑菌濃度（MIC值）采用試管二倍稀釋法測(cè)定了功勞葉提取物對(duì)供試菌的MIC值，結(jié)果見表2，當(dāng)功勞葉醇提物的濃度為31.3 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌生長受到抑制，試管中液體培養(yǎng)基澄清，當(dāng)醇提物濃度為125 mg/mL，大腸桿菌生長明顯受到抑制；當(dāng)功勞葉水提物的濃度為250 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌生長受到抑制，當(dāng)水提物濃度為500 mg/mL，大腸桿菌試管仍顯渾濁。陰性對(duì)照組中各試驗(yàn)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)。由此得出，功勞葉醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別為：31.3 mg/mL、125 mg/mL；功勞葉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別為：250 mg/mL、＞500 mg/ mL。

2.3最低殺菌濃度（MBC值）在最低抑菌濃度的基礎(chǔ)上，測(cè)得的MBC值結(jié)果見表3。由表3可知，功勞葉醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MBC值分別為：62.5 mg/mL、500 mg/mL；功勞葉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MBC值分別為：500 mg/mL、＞500 mg/mL。

3　討論

本試驗(yàn)探討了乙醇、水堤物對(duì)功勞葉活性成分抑菌效果的影響，結(jié)果顯示，功勞葉醇提物抑菌效果優(yōu)于水提物，根據(jù)“相似相溶”原理可知，其極性強(qiáng)弱為水＞乙醇，由此說明了功勞葉抑菌成分可能為中等極性成分。

表2　功勞葉提取物對(duì)供試菌的最低抑菌濃度?。∕IC值）

表3　功勞葉提取物對(duì)供試菌的最低殺菌濃度　（MIC值）

體外抑菌試驗(yàn)表明，不同的菌種對(duì)藥物的敏感度不同。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌對(duì)功勞葉醇提物分別表現(xiàn)為極敏（20.69 mm）和高敏（15.40 mm）；對(duì)水提物分別表現(xiàn)出中敏（13.54 mm）和低敏（＜10 mm）。由此說明了革蘭陽性菌對(duì)功勞葉提取物的敏感性大于革蘭陰性菌），即功勞葉革蘭陽性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭陰性菌。據(jù)金蘭梅等[14]報(bào)道，功勞葉對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果較強(qiáng)，且優(yōu)于大腸桿菌，與本試驗(yàn)的結(jié)果相符，說明功勞葉抑菌譜廣，具有較大的開發(fā)價(jià)值，但其抑菌活性具體成分尚不明確，有待進(jìn)一步分離純化。

功勞葉提取物對(duì)供試菌的MIC值、MBC值結(jié)果表明，功勞葉醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定的抑菌和殺菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為31.3 mg/mL，MBC值為62.5 mg/ mL；對(duì)大腸桿菌的MIC值為125 mg/mL，MBC值為500 mg/mL。功勞葉水提物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，其MIC值為250mg/mL，MBC值為500 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC與MBC值均大于500 mg/mL。在抑制大腸桿菌方面，張秀英等[15]報(bào)道十大功勞葉水提物對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍為15.6～250 mg/mL（生藥），醇提物對(duì)大腸桿菌的的MIC均大于250 mg/mL（生藥），周琰冰等[16]、趙鑫薈等[17]報(bào)道，功勞葉大腸桿菌的MIC為62.5 mg/mL，本研究結(jié)果與以上報(bào)道相比有明顯的差異，出現(xiàn)這種差異可能與功勞葉的種類、產(chǎn)地、提取方法，以及相同的細(xì)菌不同來源的菌株有關(guān)，有待今后進(jìn)一步探討。

臨床研究證明[18-20]，功勞葉體內(nèi)治療許多感染性疾?。?xì)菌性痢疾、流感病毒、傷寒、肺結(jié)核、急性扁桃體炎）效果很好，但本研究結(jié)果表明，其體外MIC值偏大，究其原因可能與功勞葉的抑菌機(jī)理有關(guān)，功勞葉可能與抗生素作用機(jī)制不同，其是否作用于毒素表達(dá)、表面蛋白活性或耐藥性等方面，有待于進(jìn)一步的研究。

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Studies on the Antimicrobial Activity of Extract from Mahoniain vitro

PU Zhong-hui，WANG Bao-shan2，CHEN Xi-wen1，WANG Xiong-qing1，DENG Si-xia1，ZHOU Xiao-qin1
（1.College of Life Science and Technology of Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China；2.Beijing Centre Biology Co.，Ltd.Beijing 102600，China）

Abstract：The extracts of Mahonia was prepared by water extraction and 95%ethanol refluxing method . Two extracts were used to do drug sensitive test by Oxford Plate and the tube dilution method was used to determine the Minimum Inhibitory Consistency（MIC）and Minimum Bactericidal Consistency（MBC）against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The results showed that antibacterial circle diameter of the ethanol extraction against Staphylococcus aureus and Escherichia coli was 20.69 mm and 15.40 mm，the MIC was 31.3 mg/mL and 125 mg/mL，and the MBC was 62.5 mg/mL and greater than 500 mg/mL，respectively.Antibacterial circle diameter of the water extraction against Staphylococcus aureus was 13.54 mm，the MIC and MBC were 62.5 mg/mL and 500 mg/mL，respectively.Escherichia coli was less sensitive to the water extraction of the Mahonia.The MIC was 500 mg/mL and the MBC was greater than 500 mg/mL.Different extracts showed different antibacterial activities to Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The Mahonia ethanol extraction has good inhibitory effect on Staphylococcus aureus and E.coli.

Key words：Mahonia；antimicrobial activity；MIC；MBC

Corresponding author：WANG Xiong-qing

通訊作者：王雄清，E-mail：wangxq193@126.com

作者簡介：蒲忠慧（1982-），女，講師，博士生，從事中藥藥理研究，E-mail：zhonghui.pu@163.com

基金項(xiàng)目：四川省科技廳科研項(xiàng)目（2013JY0127）

收稿日期：2014-11-28

中圖分類號(hào)：R 281.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0109- 03