高云航，徐佳萍，趙晗旭，邸海洋，王　巍，婁玉杰，馬紅霞（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春08；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春0；.長(zhǎng)春動(dòng)植物公園，吉林長(zhǎng)春006）

?

基于宏基因組學(xué)的成年和老年袋鼠腸道菌群多樣性和差異性研究

高云航1，徐佳萍2，趙晗旭1，邸海洋3，王巍1，婁玉杰1，馬紅霞1
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春130112；3.長(zhǎng)春動(dòng)植物公園，吉林長(zhǎng)春130062）

摘要：為了了解袋鼠糞便中菌群的多樣性，分析成年和老年袋鼠糞便中菌群的差異性。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定成年和老年袋鼠糞便細(xì)菌16S rDNA的V3-V4變異區(qū)序列，應(yīng)用Prinseq和Mothur等軟件整理和統(tǒng)計(jì)樣品序列數(shù)目和操作分類單元（OTUs）數(shù)量，分析菌群物種豐度、分布和Alpha多樣性。獲得成年袋鼠糞便（AK）的OTU數(shù)為7 210，老年袋鼠糞便（OK）的OTU數(shù)為6 120。AK和OK的豐富度指數(shù)分別為4 377.028/7301.574和1 430.718/1858.623，香農(nóng)指數(shù)分別為6.275和4.273。AK和OK腸道優(yōu)勢(shì)菌群均隸屬厚壁菌門，分別占65%（AK）和78%（OK），除此之外，共有優(yōu)勢(shì)菌門還有變形菌門、擬桿菌門和螺旋菌門，但AK有四種獨(dú)有菌門。獲得了成年和老年袋鼠糞便中細(xì)菌的豐富度、菌群結(jié)構(gòu)及差異性。

關(guān)鍵詞：袋鼠；腸道菌群；宏基因組學(xué)

袋鼠是典型的草食動(dòng)物，是研究哺乳動(dòng)物較好的動(dòng)物比較模型。袋鼠前腸具有獨(dú)特的消化功能，可進(jìn)行高效能量轉(zhuǎn)換，被廣泛認(rèn)為是低甲烷排放動(dòng)物[1]。由于影響袋鼠的疾病主要為口腔疾病和消化道疾病[2]，因此，開展不同年齡袋鼠糞便中細(xì)菌多樣性的研究和菌群結(jié)構(gòu)的分析可為深入研究單胃食草野生動(dòng)物消化道菌群提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為減緩動(dòng)物老齡化以及動(dòng)物消化道疾病的防控提供新思路。宏基因組學(xué)作為新興的分子生物學(xué)技術(shù)，適用于開展微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性以及其相互關(guān)系等相關(guān)研究[3]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)成年和老年袋鼠糞便進(jìn)行細(xì)菌宏基因組分析，探明不同年齡袋鼠腸道細(xì)菌的物種豐富度和差異性，為進(jìn)一步探討野生動(dòng)物的消化機(jī)制積累數(shù)據(jù)。

1　試驗(yàn)材料

袋鼠糞便：長(zhǎng)春市動(dòng)植物公園連續(xù)10 d采集4只成年健康袋鼠和4只老年健康袋鼠的新鮮糞便，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2　試驗(yàn)方法

2.1袋鼠糞便總DNA提取提取成年與老年袋鼠糞便總DNA。成年袋鼠組（AK）與老年袋鼠組（OK）采集的糞便中隨機(jī)采取每組各8g樣品，分別加入25 mL PBS，反復(fù)低速離心去除雜質(zhì)直至上清澄清，再將上清高速離心得到沉淀，預(yù)處理后采用CTAB法提取總DNA。

2.216S rDNA的擴(kuò)增利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒定量總DNA，PCR引物為已融合Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒回收DNA?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，將樣品按照比例進(jìn)行混合，混合后充分震蕩均勻，用于后續(xù)樣品建庫(kù)與測(cè)序。

表1　PCR反應(yīng)體系

2.3生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣本序列做QC。然后去除非靶區(qū)域序列及嵌合體，采用RDP classifier將序列進(jìn)行物種分類，根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。最后計(jì)算各種物種多樣性指數(shù)，衡量樣本物種多樣性。

3　結(jié)果

3.1袋鼠腸道細(xì)菌宏基因組DNA提取結(jié)果分別提取成年袋鼠（AK）和老年袋鼠（OK）糞便細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成功提取出目的DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)得DNA濃度與純度均符合宏基因組測(cè)序的基本要求（表2）。

表2　袋鼠腸道細(xì)菌宏基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

3.2細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果以提取的袋鼠糞便微生物總DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)片段的PCR擴(kuò)增，切膠回收后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成功擴(kuò)增出大小為230 bp左右的目的片段。

3.3袋鼠腸道菌群多樣性分析結(jié)果兩個(gè)樣品獲得最終用于分析的序列條數(shù)、OUT數(shù)目、香農(nóng)指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)樣品覆蓋率見表3，前插彩版圖1為香農(nóng)指數(shù)和豐富度稀疏分析圖。

表3　各樣品相關(guān)參數(shù)

3.4袋鼠腸道菌群差異性分析對(duì)單個(gè)樣品中的OUT在門和屬水平進(jìn)行歸類和整理。在門水平，AK腸道細(xì)菌隸屬于11個(gè)門，厚壁菌門（Firmicutes）占比例最大（占65%），與OK組相比，特有的菌門為互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、軟壁菌門（Tenericectes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和廣古菌門（Euryarchaeota）。OK腸道細(xì)菌隸屬于7個(gè)門，厚壁菌門所占比例仍為最大（78%），其余的3個(gè)門僅占1%，前插彩版圖2。

在屬水平，AK腸道細(xì)菌隸屬于92個(gè)屬，豐度≥2%的屬為瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）、RC9、普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）、dgA- 11、hoa5-07d05、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio），其余84個(gè)屬占19%。OK腸道細(xì)菌隸屬于80個(gè)屬，豐度≥2%的屬為瘤胃球菌屬、鏈球菌屬（Streptococcus）、Barnesiella、普氏菌屬（Prevotella）、密螺旋體屬（Treponema），其余75個(gè)屬占20%，前插彩版圖3。

4　討論

本研究采用高通量測(cè)序獲得的袋鼠糞便中細(xì)菌豐度最高的為厚壁菌門，其次是擬桿菌門，因此這些微生物可能在纖維物質(zhì)消化中起主要作用。李志鵬等[4]利用16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃細(xì)菌多樣性，結(jié)果為梅花鹿瘤胃中87.9% 的16S rRNA基因序列與普雷沃氏菌屬相似，Nelson等[5]研究報(bào)道了奶牛瘤胃及羚羊、斑馬腸道內(nèi)主要菌群，反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)最主要菌群為擬桿菌門的普雷沃氏菌，而非反芻動(dòng)物腸道主要菌群為厚壁菌門的瘤胃球菌和梭菌。袋鼠為單胃草食動(dòng)物，本研究中袋鼠糞便中微生物瘤胃球菌屬與梭菌屬為主，二者是產(chǎn)乙酸菌，利用氫氣產(chǎn)生乙酸而不是甲烷，這有可能是單胃草食動(dòng)物排放甲烷量低于反芻動(dòng)物的原因。

本試驗(yàn)主要對(duì)比分析成年袋鼠與老年袋鼠糞便中菌群的差異，結(jié)果表明，年齡對(duì)袋鼠腸道菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)有一定影響。這與一些報(bào)道結(jié)果相一致[6-7]。在門水平，軟壁菌門和疣微菌門是成年袋鼠糞便中所特有的，疣微菌門是一門被劃出不久的菌門，主要存在土壤和人類糞便中，該類細(xì)菌有很大的研究空間。在屬水平，除瘤胃球菌屬為二者最主要優(yōu)勢(shì)菌群外，成年袋鼠糞便菌群中優(yōu)勢(shì)菌群為普雷沃氏菌屬和毛螺旋菌屬，而老年袋鼠組優(yōu)勢(shì)菌屬為丁酸弧菌屬、密螺旋體屬和鏈球菌屬，普雷沃氏菌是纖維降解菌，能產(chǎn)生一系列的木聚糖酶；丁酸弧菌是一類高效木聚糖降解菌；密螺旋體屬和鏈球菌屬可能是袋鼠老齡化產(chǎn)物，甚至有可能影響袋鼠的健康狀態(tài)，這為進(jìn)一步研究動(dòng)物消化道調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。

由于高通量測(cè)序技術(shù)成本高以及野生動(dòng)物樣本采集存在一定困難，至今基于該技術(shù)對(duì)野生動(dòng)物腸道菌群多樣性的相關(guān)研究不多[8]，隨著科研的不斷深入，愈來愈多的野生動(dòng)物不同生理時(shí)期的腸道菌群將得以揭示，為進(jìn)一步探討腸道菌群的作用機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[3] Rondon M R，August P R，Bettermann A D，et al . Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms[J] .Appl Environ Microbiol，2000，66（6）：2541-2547.

[4]李志鵬，劉晗璐，崔學(xué)哲，等.基于16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃細(xì)菌多樣性[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25（9）：2044-2050.

[5] Nelson K E，Zinder S H，Hance I，et al.Phylogenetic analysis of the microbial populations in the wild herbivoregastrointestinal tract：instights into an unexplored niche[J] . Environmental Microbiology，2003，5（11）：1212-1220.

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第25屆世界家禽大會(huì)（WPC2016）暨中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)征文通知

第25屆世界家禽大會(huì)（WPC2016）暨中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)將于2016年9月5日－9日在北京國(guó)家會(huì)議中心召開，屆時(shí)中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十八次學(xué)術(shù)研討會(huì)同期舉行。本次大會(huì)由中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)主辦，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)、禽病學(xué)分會(huì)和北京博亞和訊農(nóng)牧技術(shù)有限公司協(xié)辦。

大會(huì)征文即日開始，誠(chéng)邀畜牧獸醫(yī)相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的科技工作者積極投稿，本屆年會(huì)將繼續(xù)評(píng)選優(yōu)秀論文，頒發(fā)我國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)術(shù)界的最高榮譽(yù)-“中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獎(jiǎng)”及相關(guān)分會(huì)的優(yōu)秀論文獎(jiǎng)。大會(huì)誠(chéng)摯邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外家禽行業(yè)從業(yè)者參加本次大會(huì)，就行業(yè)內(nèi)的熱點(diǎn)問題與最新的科技和產(chǎn)業(yè)進(jìn)展展開充分的交流、討論，尋找更多的合作機(jī)會(huì)，共同促進(jìn)家禽行業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1會(huì)議地點(diǎn)國(guó)家會(huì)議中心（北京市朝陽區(qū)天辰東路7號(hào)）

2會(huì)議征文的具體要求

本次會(huì)議分中英文征文，英文論文摘要將進(jìn)入世界家禽大會(huì)論文集，中文論文摘要將進(jìn)入中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集。兩個(gè)會(huì)議征文具體要求：

大會(huì)將圍繞“家禽產(chǎn)品的質(zhì)量與安全：滿足人類需要”主題，研討和交流新理論和新技術(shù)。請(qǐng)進(jìn)入會(huì)議網(wǎng)站http:// www.wpc2016.cn/zh/，點(diǎn)擊摘要選擇WPC摘要（投英文摘要入口）、年會(huì)摘要（投中文摘要入口）進(jìn)入會(huì)議投稿系統(tǒng)。具體步驟請(qǐng)參看網(wǎng)站上的使用說明。；英文摘要截止日期為2016年2月5日，中文論文截止日期為2016年6月30日。

2016年年會(huì)將繼續(xù)在投稿的在讀研究生中挑選100名免費(fèi)參加會(huì)議（免住宿、注冊(cè)費(fèi)），具體申請(qǐng)條件請(qǐng)見會(huì)議網(wǎng)站。免費(fèi)參會(huì)學(xué)生申請(qǐng)材料郵寄地址：北京市朝陽區(qū)農(nóng)展館南路9號(hào)博雅園1-106（100125）。聯(lián)系人：申凌、石娟，電話：010-85959006 85959010。E-mail：caav2007@163.com

3會(huì)議中文網(wǎng)站http://www.wpc2016.cn/zh/

4聯(lián)系方式1. WPC2016征文（英文）咨詢：連玲010-62731256 llian@cau.edu.cn，鄭江霞010-62732741 info@wpc2016.cn。2.學(xué)術(shù)年會(huì)征文（中文）、免費(fèi)參會(huì)學(xué)生、中賓參會(huì)咨詢：（1）年會(huì)征文咨詢：石娟010-85959010 caav001@163.com，（2）免費(fèi)參會(huì)研究生咨詢：申凌010-85959006 caav2007@163.com，（3）中賓參會(huì)咨詢：劉海霞010-85959010 caav123@126.com。3.贊助、媒體參會(huì)咨詢：王必勇010-82893959 meeting@boyar.cn。4.會(huì)員入會(huì)咨詢：（1）家禽學(xué)分會(huì)：竇新紅0514-85599035 jqxfhmsc@163.com。（2）禽病學(xué)分會(huì)：姚煒光010-51503677 qbxfhywg@126.com。5.團(tuán)體會(huì)員單位參會(huì)咨詢：顏海燕010-62125896，張高霞010-62125686，郭自干010-62110970，張保密010-62126106。6.住宿咨詢及外賓參會(huì)咨詢：代旭010-58166463 daixu@cytsmice.com

Study on intestinal flora in theadult and elderly kangaroos by themetagenomics

GAO Yun-hang1，XU Jia-ping2，ZHAO Han-xu1，DI Hai-yang3，WANG Wei1，LOU Yu-jie1，MA Hong-xia1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China；2.Institute of special animal and plant sciences of caas，Changchun 130112，China；3.Changchun Zoological Botanical Park，Changchun 130062，China）

Abstract：To study the diversity of bacterial flora in kangaroo feces and analyze the differences between bacterial floras in adult kangaroo feces and in elderly kangaroo，we used high-throughput sequencing to measure the V3-V4 sequences of 16S rDNA in adult and aged kangaroo feces，use Prinseq and Mothur to settle and count the amounts of sample sequences and OTUs，and analyze the abundance of bacterial species，locations and Alpha diversity . Our study got 7 210 OTUs of adult kangaroo feces，and for elderly kangaroo feces，the numbers of OTUs were 6120.The abundance indexes of adult and elderly kangaroos were 4377.028/7301.574 and 1430.718/1858.623，and the shannon indexs were 6.275 and 4.273 for adult and aged kangaroos，respectively.The dominant bacterial flora of both kangaroos belongs to Firmicutes，and they occupied 65%（AK）and 78%（OK）respectively.In addition，common dominant Eumycotas were Proteobacteria，Bacteroidetes and Spirochaetae . However，there were four unique Eumycotas in adult kangaroo feces . In conclusion，we got the abundances，bacterial structures and differences from adult and elderly kangaroos.

Key words：kangaroo；intestinal flora；metagenomics

Corresponding author：MA Hong-xia

通訊作者：馬紅霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

作者簡(jiǎn)介：高云航（1975-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生態(tài)學(xué)，E-mail：gaoyunhang@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-38）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372331）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（201358）；吉林省青年科研基金項(xiàng)目（20130522092JH）

收稿日期：2014-05-25

中圖分類號(hào)：Q969.33+1.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0103- 02