羅雪剛，夏文君，李　閣，羅永芳，彭少靜，周　念，李繼祥（.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶榮昌40460；.重慶永健生物技術有限公司，重慶　榮昌40460）

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規(guī)模化鵝場發(fā)生多種血清型鴨疫里默菌的混合感染

羅雪剛1，夏文君1，李閣2，羅永芳1，彭少靜1，周念1，李繼祥1
（1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶榮昌402460；2.重慶永健生物技術有限公司，重慶榮昌402460）

鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）為革蘭陰性小桿菌、無芽孢、不能運動、有莢膜，主要感染家鴨、鵝、火雞，但也有感染雞的報道[1]。該細菌血清型復雜且缺乏交叉免疫保護、耐藥性嚴重，導致疾病難以預防和治療。2014年5月中旬，重慶榮昌縣某規(guī)模化鵝場的18日齡鵝發(fā)病，21日齡時發(fā)病率約為30%、死亡率為10%左右，病死鵝表現為典型的心包炎、肝周炎和氣囊炎。經西南大學榮昌校區(qū)實驗室診斷，該病為多血清型鴨疫里默菌混合感染，現將病例診斷結果報道如下。

1　材料與方法

1.1病例重慶榮昌縣某規(guī)?；Z場飼養(yǎng)的肉用四川白鵝5 000余只，18日齡鵝發(fā)病，病鵝精神沉郁、食欲下降、羽毛蓬松、呼吸困難，眼鼻分泌物增多、糞便稀薄呈綠色，腿軟弱、跗關節(jié)腫大、腿部皮溫明顯高于體溫，臨死前表現為頭頸扭斜、抽搐等神經癥狀。發(fā)病鵝采用網上平養(yǎng)、密度適中、未免疫鴨疫里默菌疫苗、未使用抗菌藥物，鵝苗購自四川隆昌縣禽苗市場。2只送檢病鵝均表現為心包炎、肝周炎和氣囊炎，脾臟腫大，腦膜充血、出血。

1.2細菌分離鑒定利用巧克力和麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板從送檢鵝的肝、腦組織分離細菌，典型菌落純培養(yǎng)后從細菌形態(tài)、生化特性和鴨疫里默菌cam基因檢測[2]等方面進行鑒定。

1.3病毒檢測病死鵝肝組織勻漿反復凍融3次后離心上清液利用病毒RNA/DNA快速提取試劑盒（TaKaRa產品）提取RNA/DNA用于小鵝瘟[3]、禽流感[4]和鴨甲肝病毒[5]檢測。

1.4鴨疫里默菌血清鑒定雞抗鴨疫里默菌血清（1型、2型、4型、8型和14型），自制，-80℃保存[6]。將分離鑒定的鴨疫里默菌用巧克力平板純培養(yǎng)，按張大丙（1999）[7]報道的玻片凝集試驗進行血清型鑒定。

1.5體外藥敏試驗藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司，藥敏試驗方法和判定標準按使用說明書進行。

1.6動物試驗經鑒定為鴨疫里默菌的分離菌株用巧克力平板培養(yǎng)（37℃、24 h），生理鹽水懸浮，測定細菌數。14日齡健康鴨每只腿部肌肉接種約1×108CFU/0.2 mL的菌懸液，連續(xù)7 d觀察發(fā)病死亡情況，死亡病鴨進行剖檢與細菌回歸試驗。

2　結果

2.1細菌分離鑒定病死鵝肝和腦組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后有表面光滑、稍突起的露珠狀菌落形成；用麥康凱平板沒有分離出細菌；利用RT-PCR或PCR沒有從病死鵝肝組織中檢測到小鵝瘟病毒、禽流感病毒和鴨甲肝病毒。單菌落純培養(yǎng)物染色鏡檢為革蘭陰性小桿菌、無鞭毛和芽孢；瑞氏染色呈菌體兩極濃染。生化試驗結果顯示，分離菌株能液化明膠、不發(fā)酵糖、不產生靛基質和硫化氫、不還原硝酸鹽，過氧化氫酶陽性。利用鴨疫里默菌cam基因的特異性引物對分離菌的基因組DNA進行PCR，擴增產物經瓊脂糖電泳檢測為1 000 bp左右的單一DNA條帶。

2.2血清型鑒定從每只送檢鵝肝、腦組織劃線分離的細菌中隨機挑取5個菌落純培養(yǎng)，經鑒定為鴨疫里默菌后用于血清型鑒定。從第1只鵝腦組織分離的5株鴨疫里默菌中血清2型3株、血清4型2株；從肝臟分離的細菌中血清2型2株、血清4型2株和未定型1株。從第2只鵝分離10株細菌中，除分離于腦的1株細菌為血清14型外，其余均為血清4型。

2.3細菌體外藥敏試驗從鑒定血清型的20株鴨疫里默菌中選取8株細菌進行的體外藥敏試驗結果見表1。分離菌株對阿莫西林的敏感性好，多數菌株對頭孢曲松、羅紅霉素等的敏感性差，甚至完全耐藥。同時從表1可知，分離于同一只病鵝的相同血清型菌株間的耐藥性存在明顯差異，如分離于第1只病鵝腦組織的血清2型菌株（菌株1）對恩諾沙星耐藥（11.8 mm），而分離于肝組織的（菌株3）則敏感（18.0 mm）。

2.4致病性試驗測定藥物敏感性的8株細菌1×108CFU/0.2 mL都能在24～36 h內引起14日齡接種鴨發(fā)病、在48～60 h內發(fā)生死亡、在120 h內100%（7/7）死亡。病死鴨剖檢大體病變?yōu)榈湫偷男陌?、肝周炎和氣囊炎；都能從腦和肝臟組織中分離出與接種細菌相同血清型的鴨疫里默菌。

表1　體外藥物敏感性試驗抑菌圈的直徑（mm）及敏感性判定

3　討論

鴨疫里默菌感染鵝發(fā)病的病例報道較多，但同一鵝群存在多種血清型菌株感染，甚至從同一只病死鵝中分離鑒定出3種血清型菌株的病例未見報道。從細菌分離鑒定、動物試驗和血清鑒定等確診重慶榮昌某規(guī)?；Z場18日齡鵝發(fā)病是由4種血清型的鴨疫里默菌混合感染所致。在病例診斷中，從病理剖檢的第1只病死鵝組織中分離鑒定出3種血清型（2型、4型和未定型）鴨疫里默菌，第2只中鑒定出2種（4型和14型）；不同菌株的藥物敏感性有差異，即使是分離于同一病死鵝的同一血清型的不同菌株間也存在明顯的差異。鴨疫里默菌多血清型菌株混合感染鵝群的原因在于：種鵝的小規(guī)模飼養(yǎng)，雛鵝來源多樣化；雛鵝在禽苗市場集中交易導致交叉感染；飼養(yǎng)場沒有實行全進全出及嚴格的消毒，污染嚴重；養(yǎng)鵝場附近存在養(yǎng)鴨場，有從鴨傳染鵝的可能。

疫苗免疫預防和抗菌藥物防治是控制鴨疫里默菌感染的2種途徑，由于同一群體中存在多血清型菌株感染，且藥物敏感性不一致，這使得生產實際中藥物和疫苗的效果難以保證。因此，對于鴨疫里默菌感染的控制應采用全面實施生物安全措施的策略。

參考文獻：

[1] Li J X，Tang Y，Gao J Y，et al.Riemerella anatipestifer infection in chickens[J].Pak Vet J，2011，31（1）：65-69.

[2] Karen C C，Chua K L，Sumathi S，et al.Identification and characterization of cAMP cohemolysin as a potential virulence factor of Riemerella anatipestifer[J] . J Bacteriol，2002，184（7）：1932-1939.

[3] Chang-kwang Limn，Takahiro Yamada，Masayuyki Nakamura，et al.Detection of Goose parvovirus genome by polymerase chain reaction：istribution of Goose parvovirus in Muscovy ducklings[J] . Virus Res，1996，42：167-172.

[4]王秀榮，孫明，劉明，等.禽流感病毒RT-PCR試驗方法.中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 772-2004.

[5] Gan Y J，Huang C H，Wang X Z，et al.Epidemiological Investigation of Duck Hepatitis A Virus（DHAV）Isolated from Sichuan Basin by RT-PCR Disclose the Existence of Mixed Infection and the Feasibility of DHAV-A Evolved from C80 Strain[J] . Pak Vet J，2014，34（3）：356-360.

[6]李繼祥，黃偉，高繼業(yè)，等.西南地區(qū)鴨傳染性漿膜炎病原流行病學研究[C].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立2 0周年慶典暨第十次學術研討會論文集，蘇州：2003：995-997.

[7]張大丙，郭玉璞.我國鴨疫里默氏桿菌血清型的鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報，1999，30（6）：536-542.

通訊作者：李繼祥，E-mail：jixianglucky@126.com

作者簡介：羅雪剛（1990-），男，博士生，主要從事動物疾病的診斷研究，E-mail：122453213@qq.com

收稿日期：2014-06-13

中圖分類號：S852.61+8

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0052- 02