吳　凌，孫雨航，許楚楚，李昌盛，夏　成（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

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國內(nèi)流行犬瘟熱病毒DNA重組疫苗的初步研究

吳凌，孫雨航，許楚楚，李昌盛，夏成
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

摘要：為了探究H蛋白的免疫原性以及抗體效價(jià)，構(gòu)建了1株犬瘟熱病毒（CDV）ZH-10株H基因的真核表達(dá)載體pCI-H，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行了初步研究，并進(jìn)行了小鼠的DNA免疫試驗(yàn)。結(jié)果顯示，pCI-H免疫組血清可與感染病毒的MDCK細(xì)胞發(fā)生特異性IPMA反應(yīng)呈現(xiàn)特異的棕紅色；ELISA血清抗體滴度可達(dá)1∶28～1∶79；病毒中和抗體可達(dá)1∶11～1∶32。研究結(jié)果表明，H蛋白具有免疫原性，但誘導(dǎo)抗體效價(jià)不足，需進(jìn)一步完善。

關(guān)鍵詞：犬瘟熱；ZH-10株；H基因；真核表達(dá)；DNA重組疫苗

犬瘟熱（canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重影響特種養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。H蛋白作為CDV囊膜表面的主要糖蛋白，不僅在病毒融合、病毒組織嗜性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，且發(fā)現(xiàn)H蛋白在所有結(jié)構(gòu)蛋白中變異率最高[1]。

目前CD弱毒苗雖能有效地控制CD的流行，但由于H蛋白基因變異率大，抗原表位漂移而使毒力改變[2]，使制備的疫苗不能完全保護(hù)動(dòng)物免受異源毒株的感染。Camila及Nathalie等報(bào)道提示，H蛋白可以用于CDV的預(yù)防控制，其抗體可用于CDV感染的診斷或流行病學(xué)調(diào)查[3]。因此，篩選出具有免疫原性良好的毒株，進(jìn)而構(gòu)建出以野毒株抗原基因?yàn)楣羌艿男滦鸵呙?，具有重要的?shí)際意義。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、病毒、血清、抗體、載體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）、CDV病毒液、重組質(zhì)粒pMD18-H，真核表達(dá)載體pCI neo質(zhì)粒DNA等，由本室保存和提供；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG、羊抗兔IgG，購自Sigma公司；真核表達(dá)載體pCI和克隆載體pMD18-T，購自寶生物工程（大連）有限公司；5～6周齡BALB/c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑DMEM、Opti-MEM等，購自GIBCO公司；TRIZol LS Reagent、R Lipofectamin?2000等，購自Invitrogen公司；各種酶類以及DNA連接系統(tǒng)等，購自寶生物工程（大連）有限公司；SDSPAGE及Western Blot試劑，均購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3真核表達(dá)載體pCI-H構(gòu)建用雙酶切已獲得的重組質(zhì)粒pMD18-H和真核表達(dá)載體pCI neo質(zhì)粒DNA。將回收的H基因片段和pCI neo線性化質(zhì)粒，經(jīng)T4 DNA Ligase連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，抗性篩選后提取質(zhì)粒。擬獲得的重組真核表達(dá)載體命名為pCI-H。

1.4pCI-H酶切及PCR鑒定經(jīng)單酶切和雙酶切鑒定pCI-H。以酶切正確的質(zhì)粒為模板，利用HF/ HR引物針對(duì)H基因進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆，送Invitrogen公司測序，驗(yàn)證其正確的ORF。

1.5pCI-H大量制備和純化參照Wziard Pure-Fection Plasmid DNA Purification System試劑盒說明書進(jìn)行提取。對(duì)獲得的質(zhì)粒DNA測定OD260/ OD280值。

1.6pCI-H轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染前8 h，消化MDCK細(xì)胞，待達(dá)到約50%左右細(xì)胞密度，棄去培養(yǎng)液，用DMEM清洗后，Opi-MEM作用2 h，按照Lipofectamin?2 000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.7轉(zhuǎn)錄體mRNA的檢測轉(zhuǎn)染48 h后收集3組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA的濃度，立即以提取的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR操作，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄。

1.8間接免疫熒光（IIF）檢測pCI-H的體外表達(dá)

將轉(zhuǎn)染pCI-H的細(xì)胞以合適密度接種到培養(yǎng)板上，常規(guī)方法培養(yǎng)后利用IIF檢測pCI-H在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。

1.9表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE和Western Blot分析刮取轉(zhuǎn)染后48 h的MDCK細(xì)胞同培養(yǎng)液一起離心取沉淀后加入20 μL PBS重懸細(xì)胞，加入等體積的2倍緩沖液，振蕩均勻，裂解細(xì)胞，然后進(jìn)行12%SDS-PAGE及Western Blot分析以驗(yàn)證H蛋白的表達(dá)情況。

1.10重組真核表達(dá)載體pCI-H的動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)取10只5～6周齡健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為2組，觀察3 d后，肌肉注射pCI-H和空載體pCI neo，免疫程序參照表1；免疫前剪尾采血，4免后7 d眼眶采血，均分離血清備用。

表1　動(dòng)物免疫程序

1.11IPMA檢測抗血清與病毒的結(jié)合能力為驗(yàn)證免疫血清能否與病毒表達(dá)在感染細(xì)胞表面結(jié)合，以ZH10株接種MDCK細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)、洗滌、干燥、固定后加入4免后獲得的抗血清及CDV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，作用洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG，以AEC顯色。

1.12ELISA檢測血清中抗H抗體用MDCK細(xì)胞大量增殖ZH10株病毒粒子，上清液離心濃縮純化后作為診斷抗原。依照常規(guī)間接ELISA操作程序進(jìn)行。在酶標(biāo)儀上測定OD450nm值。

1.13SN檢測血清中抗H抗體采用固定病毒-稀釋血清法[4]。并設(shè)置病毒、血清毒性、陽性和陰性血清及空白細(xì)胞等對(duì)照組。

將病毒與血清的混合物接種MDCK細(xì)胞單層，最后接種病毒對(duì)照組。逐日記錄CPE的出現(xiàn)情況。被檢血清孔出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細(xì)胞出現(xiàn)保護(hù)者為陽性，中和試驗(yàn)的結(jié)果是計(jì)算出能保護(hù)50%的孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為此血清中和抗體效價(jià)（滴度指P/N≥2.1時(shí)血清最大稀釋倍數(shù)）。

2　結(jié)果

2.1重組真核表達(dá)載體pCI-H的酶切及PCR鑒定重組質(zhì)粒pCI-H雙酶切后，得到約1 824 bp和5 428 bp片段，單酶切線性化后得到大小約7 185 bp的DNA片段，與預(yù)期值大小一致（圖1）；pCI-H 的H片段PCR擴(kuò)增得到約1 824 bp片段，與H基因大小一致（圖2）。表明重組質(zhì)粒pCI-H構(gòu)建成功。

圖1　重組質(zhì)粒pCI - H的酶切鑒定結(jié)果M1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL-2 000）；M2：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL-15 000）；1：pcDNA3.1-H質(zhì)粒；2：經(jīng)Kpn I和Not I雙酶切結(jié)果（約1 824 bp和5 361 bp）；3：經(jīng)Kpn I單酶切結(jié)果（約7 185 bp）

2.2重組真核表達(dá)載體pCI-H DNA的提取和純化經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定濃度為3.88 μg/μL，OD260/OD280值為1.96，瓊脂糖凝膠電泳中超螺旋≥70%，說明所提質(zhì)粒的濃度和純度較好，可以滿足轉(zhuǎn)染和免疫動(dòng)物的需要。

圖2　重組質(zhì)粒pcDNA3.1- H的PCR鑒定結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL-2 000）；1：pcDNA3.1-H的PCR擴(kuò)增結(jié)果（1 824 bp）；2：陰性對(duì)照

2.3重組真核表達(dá)載體pCI-H在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)及檢測

2.3.1表達(dá)產(chǎn)物RT-PCR檢測RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約為1 824 bp，與理論值相符。

2.3.2IIF檢測pCI-H DNA轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)特異性亮綠色熒光，而原載體DNA轉(zhuǎn)染后未見上述熒光信號(hào)，表明該真核表達(dá)重組質(zhì)粒在細(xì)胞表面可以正確高水平表達(dá)H蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物有較好的反應(yīng)原性。

2.3.3SDS-PAGE電泳及Western Blot檢測結(jié)果顯示，在pCI-H轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞樣品中出現(xiàn)了大小約為84 kD的蛋白條帶，且能與CDV多抗發(fā)生特異性反應(yīng)，在蛋白印記中出現(xiàn)特異性條帶，而對(duì)照沒有相應(yīng)的條帶（圖3）。這表明H蛋白獲得了表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)原性。

圖3　SDS- PAGE電泳（左）和Western Blot（右）檢測H蛋白體外表達(dá)M：預(yù)染蛋白Marker；1：pCI -H轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；2：pCI neo對(duì)照

2.4重組真核表達(dá)載體pCI-H的動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)

2.4.1IPMA試驗(yàn)如圖4所示，病毒感染細(xì)胞與制備抗血清結(jié)合，細(xì)胞呈棕紅色，而未接種的細(xì)胞無著色反應(yīng)。表明該重組質(zhì)粒在鼠體內(nèi)獲得正常表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體能夠與犬瘟熱病毒結(jié)合。

2.4.2ELISA檢測小鼠血清中的抗H抗體結(jié)果顯示，pCI-H免疫小鼠抗體滴度達(dá)1∶28～1∶79，而原載體pCI（＋）質(zhì)粒DNA為陰性，說明pCI-H能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗H抗體。

圖4　IPMA試驗(yàn)結(jié)果（50×）a：病毒感染的MDCK-SLAM細(xì)胞；b：陰性對(duì)照

2.4.3免疫后誘導(dǎo)的血清中和抗體試驗(yàn)組所有小鼠均可檢測出1∶11～1∶32的病毒中和抗體，而對(duì)照組均為陰性。證明pCI-H具有誘導(dǎo)產(chǎn)生血清中和抗體的能力。

3　討論

H蛋白是CDV與細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為76 000，存在于CDV膜表面，毒株不同其基因編碼的氨基酸殘基數(shù)也不同，CDV H蛋白有廣泛而未被蛋白酶剪切的糖基化位點(diǎn)。一般認(rèn)為H蛋白是產(chǎn)生中和抗體的主要靶抗原，具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）表位，能誘發(fā)特異

的CTL活性[1]，其在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與高效價(jià)的中和抗體在抵抗CDV感染中具有重要意義，并與病毒的清除呈正相關(guān)[5]。有研究表明，CDV囊膜蛋白H免疫原性強(qiáng)于F[6]。

本試驗(yàn)將H基因克隆到pCI neo表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pCI-H，在分子水平上成功轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯H基因，結(jié)果表明，pCI-H表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。但免疫后的小鼠血清抗體滴度偏低，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱，可能是由免疫保護(hù)不足、基因表達(dá)水平低，免疫滯后等原因引起。由于未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞免疫又未進(jìn)行測定，所以目前尚難解釋。此外，免疫操作及疫苗使用不當(dāng)?shù)戎T多因素都會(huì)影響免疫效果，下一步需在這些方面加以探討，以提高免疫誘導(dǎo)抗體水平。而關(guān)于反應(yīng)原性不理想，圖3所示的表達(dá)效率低，我們將會(huì)在載體設(shè)計(jì)以及H基因的分析與片段篩選上進(jìn)一步優(yōu)化。綜上所述，pCI-H DNA重組疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CDV的中和抗體，但抗體效價(jià)不足，有待進(jìn)一步完善。

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A preliminary study of domestic popular caninedistemper vaccine

WU Ling，SUN Yu-hang，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIA Cheng
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：The objective of this study was to determine the immunogenicity and antibody titer of the H protein.A recombinant eukaryotic expression plasmid pCI-H was constructed to initially study the immunogenicity of the expressed products.Subsequently the immune response induced by pCI-H DNA immunization was analyzed in mice.Results showed that the serum from the immunized groups with pCI-H could react with MDCK cells infected by virus and had specifically bright red fluorescence .The antibody tilters of ELISA could reach 1∶28 to 1∶79，and SN could be up to 1∶11 to 1∶32.The results suggest that H protein has the immunogenicity，However，it is insufficient to induce higher level of antibodies，and need to be further improved.

Key words：canine distemper virus；ZH-10 strain；H gene；eukaryotic expression；recombinant DNA vaccines

Corresponding author：XIA Cheng

通訊作者：夏成，E-mail：xcwlxyf@sohu.com

作者簡介：吳凌（1966-），女，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：wuling8@163.com

收稿日期：2014-05-28

中圖分類號(hào)：S852.65+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0041- 03