林祥超，高志強(qiáng)，張鶴曉，張　康，郭金玉，牛建蕊，張樂萃（.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島6609；.北京出入境檢驗檢疫局，北京通州0006；.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京懷柔000；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州70050）

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豬圓環(huán)病毒2型ORF- 2全基因重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定

林祥超1，高志強(qiáng)2，張鶴曉2，張康3，郭金玉1，牛建蕊4，張樂萃1
（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京通州100026；3.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京懷柔101400；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050）

摘要：擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型的ORF-2全基因（702 bp），將目的片段與缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMV K-NpA連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒CMV-ORF-2。將穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2-100經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pac I線性化后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組。7～15 d后獲重組腺病毒rAd5 CMV-ORF-2與對照組重組腺病毒rAd5 CMV-GFP。使用293細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖，對增殖穩(wěn)定的rAd5 CMV-ORF-2進(jìn)行鑒定；rAd5 CMV-ORF-2 TCID50為107.5/50 μL，用該代次rAd5 CMV-ORF-2進(jìn)行PCV-2陽性血清中和試驗，結(jié)果表明，重組腺病毒成功，PCV-2陽性血清不能中和重組腺病毒。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；ORF-2；缺陷型重組腺病毒

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV），依據(jù)病毒的核酸序列差異可將病毒分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV-1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）。PCV-2是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）等疾病的主要病原[1]。在PCV-2型的基因序列中ORF-1和ORF-2是兩個主要閱讀框。ORF-1編碼的Rep蛋白與病毒的復(fù)制相關(guān)，ORF-2編碼Cap蛋白，是PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，并具有特異性表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[2]。因此，PCV-2型的ORF-2 Cap蛋白被廣泛研究應(yīng)用于PCV-2型的檢測與疫苗的研發(fā)[3]。

隨著腺病毒作為載體研究的日益完善，其自身感染宿主細(xì)胞廣泛，病毒滴度高，安全性好等優(yōu)點(diǎn)在基因工程疫苗領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[4]。近年來的各項研究表明，缺陷型人5型重組腺病毒載體表達(dá)蛋白用于疫苗研制具有良好的應(yīng)用前景[5]。因此，結(jié)合復(fù)制缺陷型腺病毒載體，進(jìn)行PCV-2 Cap蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研制PCV-2型新型疫苗提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑PCV-2型陽性病料、PCV-2陽性血清、293T、293細(xì)胞株由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)保存；復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)系統(tǒng)RAPAd?CMV Adenoviral Expression System，購自美國Cell Biolabs公司。

1.2引物依據(jù)GenBank多組PCV-2序列，設(shè)計擴(kuò)增引物：P1：5′-GGGGTACCATGGCGTATCCAAG GAGGCGTTACC-3′酶切位點(diǎn)Kpn I；P2：5′-CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3′酶切位點(diǎn)Hind III。

1.3T-ORF-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取陽性病料中PCV-2 DNA，使用擴(kuò)增引物進(jìn)行ORF-2擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物ORF-2與T-Vector pMD-19連接，構(gòu)建T-ORF-2重組質(zhì)粒，對T-ORF-2進(jìn)行測序。

1.4重組腺病毒的構(gòu)建、包裝與增殖連接腺病毒穿梭載體pacAd5 CMV K-NpA與ORF-2，獲得重組腺病毒穿梭載體CMV-ORF-2。對CMVORF-2進(jìn)行雙酶切、測序鑒定后，使用Pac I酶線性化CMV-ORF-2、對照穿梭質(zhì)粒CMV-GFP及骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2-100，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染7～15 d出現(xiàn)明顯病變，收獲重組腺病毒P0，使用293細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖，獲得增殖穩(wěn)定的重組腺病毒rAd5 CMV-ORF-2與對照組重組腺病毒rAd5 CMV-GFP。

1.5重組腺病毒rAd5 CMV-ORF-2鑒定提取rAd5 CMV-ORF-2、rAd5 CMV-GFP、健康293細(xì)胞總RNA，使用擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。

1.6Westen Blot鑒定取rAd5 CMV-ORF-2接毒細(xì)胞、rAd5 CMV-GFP接毒細(xì)胞和健康293細(xì)胞混合SDS Buffer后沸水煮10 min，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.7TCID50的測定與陽性血清中和試驗取P7 代rAd5 CMV-ORF-2，對照組rAd5 CMV-GFP病毒液進(jìn)行TCID50測定。根據(jù)TCID50測定結(jié)果，進(jìn)行rAd5 CMV-ORF-2、rAd5 CMV-GFP中和試驗。

2　試驗結(jié)果

2.1ORF-2擴(kuò)增與T-ORF-2雙酶切結(jié)果擴(kuò)增獲得大小為702 bp的目的片段（見圖1），重組穿梭質(zhì)粒CMV-ORF-2雙酶切得到大小為702 bp的目的片段（見圖2），與預(yù)期大小相符。CMV-ORF-2與T-ORF-2測序結(jié)果一致，與國內(nèi)分離株（AY424401.1）核苷酸序列同源性為100%。另外，使用腺病毒載體擴(kuò)增引物CMV-F進(jìn)行通測，腺病毒載體序列正確，無移碼、突變、缺失，保證了重組目的片段ORF-2的正確表達(dá)。

圖1　ORF- 2基因擴(kuò)增MI：DL-2 000；1：擴(kuò)增ORF-2全基因PCR產(chǎn)物；2：陰性對照

圖2　CMV- ORF- 2質(zhì)粒雙酶切M1：DL-15 000；M2：DL-2 000；1：CMV-ORF-2雙酶切結(jié)果；2：PCV-2病毒DNA擴(kuò)增結(jié)果

2.2RT-PCR鑒定結(jié)果rAd5 CMV-ORF-2組提取RNA擴(kuò)增目的條帶與CMV-ORF-2擴(kuò)增條帶大小一致（702 bp）。rAd5 CMV-GFP與健康293細(xì)胞提取RNA無擴(kuò)增條帶（見圖3），證明重組腺病毒能夠有效感染宿主293細(xì)胞，進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。

2.3Western Blot鑒定結(jié)果SDS-PAGE試驗未見明顯特意條帶，Western Blot結(jié)果可見大小為30kD左右的目的蛋白（見圖4），蛋白大小與PCV-2-ORF-2 Cap蛋白大小相符，因此，目的蛋白能夠真核表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。

2.4TCID50測定與中和試驗結(jié)果10-6稀釋度全部病變，10-7稀釋度有3孔出現(xiàn)病變，依據(jù)Reed-Muench法計算，P7代rAd5 CMV-ORF-2的TCID50為107.5/50 μL。使用多份PCV-2陽性血清進(jìn)行中和試驗。試驗表明，PCV-2陽性血清不能中和rAd5 CMV-ORF-2。

圖3　RT- PCR鑒定1：rAd5 CMV-GFP組細(xì)胞；2：rAd5 CMV-GFP擴(kuò)增結(jié)果；3：CMV-ORF-2擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DL-2 000；4：健康293細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果

圖4　Western- Blot鑒定1：rAd5 CMV-ORF-2擴(kuò)增結(jié)果；2：健康293細(xì)胞；3：rAd5 CMV-ORF-2接毒細(xì)胞；M：蛋白預(yù)染Marker

3　討論

PCV-2-ORF-2編碼PCV-2核衣殼Cap蛋白，是PCV-2的主要免疫性蛋白。因此，在PCV-2診斷與疫苗研制方面具有重要地位[6]。研究表明[7]，PCV相同基因型不同毒株間序列同源性大于90%，不同基因型毒株間同源性僅為68%～79%，各個國家存在的PCV也存在較大差異[8]。本試驗中，從陽性病料中分離獲得的PCV-2型與國內(nèi)分離株（AY424401.1）堿基同源性為100%，但與其他PCV-2毒株還存在差異。

腺病毒包裝與增殖過程中發(fā)現(xiàn)，293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較293細(xì)胞高，但病毒增殖效率很低，而293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較低。因此，選擇用293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，293細(xì)胞進(jìn)行增殖。試驗表明，效果較好，病毒滴度最高能夠達(dá)到108.37/50 μL TCID50。實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染包裝階段細(xì)胞代次及細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要。建議使用代次低，狀態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行。在病毒收獲時發(fā)現(xiàn)，上清中存在重組腺病毒，且病毒含量低于細(xì)胞中病毒含量，因此，在進(jìn)行病毒增殖過程中，為了能夠更快達(dá)到病毒擴(kuò)增效果，離心收集接毒細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融作為母液進(jìn)行前期下一代擴(kuò)增，在病毒毒力穩(wěn)定后，僅收集細(xì)胞毒量與收集細(xì)胞與培養(yǎng)基混合液毒力差別不大。

在TCID50測定中，病毒在10-8稀釋度時已不能引起細(xì)胞病變，但在相同稀釋度的對照組rAd5 CMV-GFP，仍能夠觀察到有熒光，因此在病毒濃度或含量較低的情況下，可使用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行鑒定（此方法待發(fā)表），在10-9稀釋度時仍能準(zhǔn)確檢測出病毒，適合病毒增殖初期時的檢測，也可以比較直觀的觀察病毒增殖情況。

使用PCV-2陽性血清不能中和重組腺病毒，這可能與腺病毒表達(dá)的靶蛋白不存在于重組病毒粒子表面有關(guān)，避免了母源抗體對PCV-2重組疫苗免疫效果的干擾。近年來，腺病毒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類基因治療中[5]，并且在自然條件下豬體內(nèi)不存在針對人5型腺病毒載體的特異性抗體，避免其他免疫原對機(jī)體產(chǎn)生的刺激和影響。因此，腺病毒作為疫苗載體及相關(guān)診斷方法的研究將有良好的前景與優(yōu)勢。

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Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Containing the ORF- 2 Complete Geneof Type2 Porcine Circovirus

LIN Xiang-chao1，GAO Zhi-qiang2，ZHANG He-xiao2，ZHANG Kang3，GUO Jin-yu1，NIU Jian-rui4，ZHANG Le-cui1
（1.Animal Science and Technology College，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China；3.Beijing Senkang Biotech Development Co.，Ltd，Beijing 101400，China；4.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou 730050，China）

Abstract：The 702 bp ORF 2 of PCV-2 was amplified and cloned into the defective adenovirus shuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA to construct recombinant shuttle plasmid CMV-ORF2.The shuttle plasmid and backbone plasmid pacAd5 9.2-100 were linearized using the restriction enzyme Pac I，and were then cotransfect into 293T cells.The ORF2 complete genome recombinant adenovirus rAd5 PCV-2 and the control CMV-GFP recombinant adenovirus rAd5 were obtained 7 to 15 days later.The recombinant viruses were propagated and identified in 293 cells . The recombinant viruses were stable in propagation and the TCID50of rAd5 CMV-ORF2 was 107.5/50 μL.The PCV-2 positive sera and rAd5 CMV-ORF2 were used in neutralization test.The results showed that the construction succeeded and PCV-2 positive sera could not neutralize the recombinant adenovirus.

Key words：Porcine circovirus type 2；ORF-2；Defective recombinant adenovirus

Corresponding author：ZHANG Le-cui

通訊作者：張樂萃，E-mail：lczhang@qau.edu.cn

作者簡介：林祥超（1989-），女，碩士生，研究方向為動物病毒學(xué)，E-mail：muyangzhao@126.com

基金項目：質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項目（201310253）

收稿日期：2015-08-26

中圖分類號：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0024- 03