劉小蘭，賀　筍，陳蘭玲，杜久斌（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆烏魯木齊830011）

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豬流行性腹瀉病毒（XJ - DB2）株的分離鑒定

劉小蘭，賀筍，陳蘭玲，杜久斌
（新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆烏魯木齊830011）

摘要：從新疆佃壩地區(qū)某豬場疑似流行性腹瀉病毒（PEDV）感染的仔豬中采集肛拭子樣品，將其接種到Vero細胞中，連續(xù)傳代培養(yǎng)，并逐日觀察細胞病變（CPE），分離得到一株PEDV病毒，命名為新疆佃壩2株（XJ-DB2）。將分離的XJ-DB2株進行ORF3基因序列分析比對和遺傳進化分析，結果表明，XJ-DB2株為PEDV強毒株。其ORF3基因和我國分離的強毒株CHS株、CHGS株，韓國分離的強毒株處在同一個分支上，而目前廣泛使用的疫苗毒株CV777、韓國分離的弱毒株、我國分離的弱毒株CHJS07則處在相對獨立的分支上。XJ-DB2與CHS基因的核苷酸同源性最高為99.0%，與韓國分離的強毒株S-DR13同源性為98.8%，而與疫苗株CV777核苷酸同源性為97.3%。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；ORF3基因；序列分析

自1971年首次在英國的豬群中發(fā)生豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）以來，直至1978年，英國和比利時才證實引起PED的病原為冠狀病毒[1]。PED是由流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。在出生仔豬1～2周齡時，死亡率高達90%[2]。由于PED與豬傳染性胃腸炎（TGE）等其他豬的消化道傳染病近似，單靠臨床癥狀和組織病理學檢查來作出鑒別診斷是比較困難的，所以，PED的診斷要借助于血清學和病毒學的檢驗。但是，由于PEDV未能適應在傳代細胞培養(yǎng)物中增殖，直到1988年，Hoffmann等首次在培養(yǎng)基中含胰酶的Vero細胞上成功繁殖了PEDV，并認為胰酶對PEDV纖突糖蛋白切割作用增強了病毒對Vero細胞的感染力，此方法在后續(xù)的PEDV分離、細胞培養(yǎng)和疫苗的研究中被廣泛應用[3]。

PEDV為不分節(jié)段的線性單股正鏈RNA，其中ORF3位于sM蛋白和S蛋白之間，編碼功能未知的多肽性片段，其編碼分子量為25.3 ku[4-6]。Park等（2007）對PEDV強、弱毒的ORF3序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)致弱的PEDV在ORF3有17個氨基酸的缺失，為強、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據(jù)，推測這是和病原性密切相關的重要位點（Seong-JunPark，2007）[7]。已有的研究顯示，ORF3與病毒毒力有關（Duarte M，et al，1994）[8]。

本研究針對新疆某豬場發(fā)生的流行性腹瀉，采集腹瀉仔豬肛拭子，采用特殊的病毒分離方法，分離到1株豬流行性腹瀉病毒，通過分子生物學方法進行了鑒定和對ORF3基因進行了序列分析，充分評估該毒株的變異情況，從而為疫情防控提供了試驗依據(jù)。

1　材料

1.1病料疑似流行性腹瀉病毒（PEDV）感染的仔豬肛拭子。

1.2細胞非洲綠猴傳代腎細胞（Vero）由本實驗室保存。

1.3細胞培養(yǎng)基及血清細胞培養(yǎng)基MEM和胎牛血清，均購自Hyclone公司。

1.4質粒與菌種DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室制備、保存；pMD19-T載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.5主要試劑核酸提取試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒，購自天根生物科技（北京）有限公司。

1.6引物參照GenBank中登錄的PEDV毒株的ORF3基因序列，設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2　方法

2.1PEDV的分離及在Vero細胞中傳代培養(yǎng)

取適量處理后的腹瀉病料接種鋪滿單層的Vero細胞，感作過夜，次日，棄去毒液，用PBS沖洗3次，添加5 mL無血清MEM培養(yǎng)基（添加適量胰酶），置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每日觀察細胞狀態(tài)，72 h收獲病毒，反復凍融3次后置-80℃以下保存，備用。按以上相同的方法將病毒在Vero細胞上連續(xù)傳代。

2.2引物的設計與合成參照GenBank中登錄的PEDV毒株的ORF3基因序列，設計引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，片段跨幅為整個ORF3基因，長度大小約為833 bp，該引物的序列為上游引物F：5′-TCCTAGACTTCAAC CTTACG-3′；下游引物R：5′-GGTGACAAGTGAAG CACAGA-3′。

2.3ORF3開放閱讀框的克隆與序列測定用所設計引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳，經(jīng)膠回收試劑盒切膠回收，純化后與T載體連接，轉化感受態(tài)細胞DH5α，用PCR方法鑒定重組質粒，選擇陽性重組質粒送測序公司測序。

2.4PEDV ORF3序列比對將測序回復的序列經(jīng)DNAStar軟件拼接后與我國分離的CHS株，CHGS株，韓國分離的S-DR13株，經(jīng)典CV777弱毒株，韓國弱毒株Attenuated DR13株（A-DR13），CHJS07弱毒株進行遺傳進化分析繪制其遺傳進化關系樹。

3　結果

3.1病毒的分離與傳代XJ-DB2株經(jīng)Vero細胞傳至第6代，無典型細胞病變，傳至7代時出現(xiàn)輕微細胞病變，至第8代，細胞變圓，空泡化，形成合胞體，進而細胞脫落死亡，出現(xiàn)典型的細胞病變，如圖1所示。隨著代次增加，細胞病變趨于穩(wěn)定，病變時間基本維持不變。本毒株在Vero細胞傳代過程中，接毒量占總體積的10%左右，病變時間基本維持在48 h，病毒的TCID50可達106.0/mL。

圖1　正常細胞對照及病變細胞A：未接種PEDV病毒的Vero細胞；B：接種PEDV 48 h后病變的Vero細胞

3.2PEDV目的片段的RT-PCR鑒定用本實驗室自己設計并合成的特異性引物進行RT-PCR擴增，結果如圖2所示，擴增片段大小約833 bp。

圖2　目的片段的RT- PCR擴增注：1：目的片段；2：DNA Marker 2 000；3：PCR陰性對照

3.3ORF3遺傳進化分析將本試驗的分離株DB2與我國分離的CHS株，CHGS株，韓國分離的S-DR13株，經(jīng)典CV777弱毒株，韓國致弱的A-DR13株，CHJS07弱毒株等的ORF3全基因序列應用DNAStar繪制遺傳進化樹（Clustal W Method）。從PEDV ORF3基因遺傳進化可以看出，PEDV在遺傳進化上呈2個明確的分支：強毒株和弱毒株（圖3），強毒株又可分為2個亞群。從進化樹上可以看出本次分離的強毒株與我國分離的CHS株和韓國分離的強毒株S-DR13處在同一分支上。XJ-DB2與CHS基因核苷酸同源性最高為99.0%，其次與韓國分離的強毒株S-DR13同源性為98.8%，而與疫苗株CV777核苷酸同源性為97.3%。

圖3　XJ - DB2株ORF3基因遺傳進化樹

4　討論

病毒分離的主要目的是通過對病毒的檢測和純化，獲得純化的病毒粒子，并將其進行傳代培養(yǎng)。自20世紀70年代初發(fā)現(xiàn)PEDV以來，曾用各種方法試圖把病毒適應于細胞培養(yǎng)，但是都沒有成功，成為病毒學上的一道難題。直到1988年瑞典Hoffman等首次在Vero傳代細胞的培養(yǎng)液中添加胰酶，病毒培養(yǎng)獲得成功。本研究參考國內(nèi)外文獻，將胰酶濃度控制在3～8 μg/mL，在Vero細胞中連續(xù)傳代而獲得XJ-DB2毒株。雖然Vero細胞是目前用于分離培養(yǎng)PEDV的最佳細胞系，但是Vero細胞不同來源差異、毒株間的差異及培養(yǎng)條件均是影響成功分離PEDV的重要因素。

ORF3是PEDV基因組中惟一的附屬基因，PEDV野毒株在ORF3基因上存在差異[9]。因此，開展以ORF3基因為基礎的PEDV序列分析具有重要意義。本研究中分離得到的PEDV新疆株ORF3基因序列分析結果顯示，其ORF3基因沒有堿基缺失或插入，大小為675 bp，編碼224個氨基酸蛋白。該毒株與我國分離的強毒株CHS株，CHGS株，韓國分離的強毒株S-DR13株，親緣關系較近，與CHS基因的核苷酸同源性最高為99.0%，與韓國分離的強毒株S-DR13同源性為98.8%，而與疫苗株CV777核苷酸同源性為97.3%。表明新疆近年來流行病毒株基因發(fā)生變異。

在過去的30年間，流行性腹瀉病毒在亞洲豬場中的感染非常嚴重，2010年以來，我國暴發(fā)流行了仔豬腹瀉，在我國PEDV感染給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，流行性腹瀉病毒季節(jié)性變得不明顯，很多地方出現(xiàn)常年發(fā)病的情況，所以，現(xiàn)在很多豬場已開始不分季節(jié)，全年常態(tài)化免疫母豬。而PEDV變異株在細胞上的成功培養(yǎng)對其研究具有重要意義，為研究PEDV生化特性、疫苗制備及其相關分子生物學的研究奠定了基礎。

參考文獻：

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Isolation and identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus strain XJ - DB2 in Xinjiang Province

LIU Xiao-lan，HE Sun，CHEN Lan-ling，DU Jiu-bin
（Xinjiang tencon Livestock Biotechnology Co.，Ltd，Urumqi 830011，China）

Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）XJ-DB2 strain was isolated from piglets suffering from a severe diarrhea in a pig farm of Xinjiang Province Dianba Area using Vero cell based on continuous passage culture and daily observation of cytopathic effect（CPE）.The PEDV ORF3 gene was used for genetic and phylogenetic analysis.The results showed that the isolated XJDB2 was a virulent strain.Based on the genetic evolutionary，the PEDV strains which isolated in China（virulent CHS and CHGS）and South Korea（S-DR13）were in the same phylogenetic relationship，whereas the candidate vaccine strains CV777 attenuated DR13 and CHJS were in the other phylogenetic lineage.Compared with the ORF3 sequences published previously in GenBank by DNA Star software，the ORF3 sequence of XJ-DB2 strain had the highest nucleotide homology at 99.0%with CHS strain，and 98.8%with S-DR13.It also had 97.3%homology with the Vaccine strain CV777.

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；Isolation and identification；ORF3 gene；Genetic analysis

作者簡介：劉小蘭（1981-），女，助理獸醫(yī)師，本科，從事獸用疫苗研發(fā)工作，E-mail：122830140@qq.com

收稿日期：2014-09-19

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0017- 03