孫玉燕，牛曉偉，范 敏(浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)

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黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV及葫蘆科作物抗性遺傳改良研究進展

孫玉燕，牛曉偉，范 敏*
(浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)

摘 要：黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是侵染葫蘆科作物的重要病毒之一,對葫蘆科作物的生產造成了嚴重威脅。本文對CGMMV的分布和分類,全基因組序列、進化關系及結構,CGMMV的檢測方法,以及葫蘆科CGMMV抗性的遺傳分析及遺傳改良包括抗性材料的篩選及種間雜交、基于基因工程的遺傳改良、miRNAs測序及人工miRNAs等方面的研究進展進行綜述。另外,對葫蘆科作物CGMMV抗性遺傳改良中存在的問題及應對策略進行了探討和展望。

關鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒;基因組;遺傳分析;遺傳改良

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160232

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)隸屬于蕪菁花葉病毒科煙草花葉病毒屬［1］,具有較廣泛的寄主范圍,主要侵染黃瓜、西葫蘆、葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜、絲瓜、苦瓜和蛇瓜等葫蘆科作物［2］,也可侵染莧色藜、曼陀羅、馬齒莧、本氏煙和矮牽牛等作物［3］。CGMMV可引起葉片斑駁、系統(tǒng)花葉、褪綠、萎黃、褶皺,以及植株矮化、生長緩慢、結果延遲等癥狀,在成熟期可導致果實腐爛和纖維化,失去食用和商業(yè)價值［4-6］,給葫蘆科作物生產造成嚴重威脅。

1　CGMMV的分布和分類

1.1分布范圍

目前,CGMMV在全世界30多個國家和地區(qū)均有分布。最早于1935年由英國的Ainsworth報道在黃瓜上發(fā)生［7］,隨后傳入西班牙、德國、羅馬尼亞、希臘和波蘭等歐洲國家［8-12］; 20世紀60—70年代,因黃瓜、西瓜和瓠瓜引種而傳入亞洲的日本、印度和伊朗［13-15］; 20世紀80—90年代傳入韓國、我國臺灣地區(qū)、前蘇聯(lián)、以色列和沙特阿拉伯［5,16-19］; 21世紀初,幾乎所有的歐洲國家,以及中亞、東亞和南亞一些國家均有發(fā)生［11-12］。近年開始傳入北美洲的加拿大和美國［20-22］。2002年,中國口岸檢疫部門首次從日本引進的種苗中發(fā)現CGMMV。2004年,廈門出入境檢驗檢疫局再次從日本進口的南瓜種子上檢測到CGMMV［23］。隨后在遼寧、北京、浙江、河北、甘肅、海南等地發(fā)生多起進口源性CGMMV,給農業(yè)生產造成巨大損失。為此,2006年12月21日,農業(yè)部發(fā)布了第788號公告,將CGMMV確定為全國農業(yè)植物檢疫性有害生物之一。

1.2分類

根據報道地域和鑒別寄主莧色藜、曼陀羅等植物上的侵染癥狀,可將CGMMV分為6個株系［24］。

典型株系。即黃瓜綠斑駁花葉病毒。在英國和歐洲有報道［7］。果實上通常不引起癥狀,特定條件下在莧色藜上引起少量局部枯斑,不侵染曼陀羅和矮牽牛。

黃瓜桃葉珊瑚花葉株系。英國和歐洲有報道,印度也有類似株系的報道。在果實上可以引起顯著的果實癥狀,在莧色藜上引起局部枯斑,而在曼陀羅上無癥狀。

西瓜株系。日本有報道［4］,在莧色藜上引起局部枯斑,而在曼陀羅上無該癥狀。

日本黃瓜株系。日本有報道［4］,在黃瓜上引起嚴重的果實畸形,在曼陀羅上引起局部枯斑,但莧色藜上無癥狀。

洋東株系。在洋東河日本的黃瓜上有記載,引起黃瓜果實畸形,在莧色藜、曼陀羅和矮牽牛上引起局部枯斑。

印度株系。在印度的葫蘆科植物上有記載,引起泡斑、矮化和產量降低;在莧色藜上引起局部枯斑,在接種曼陀羅的葉片上不表現癥狀,不侵染煙草和矮牽牛。

2　CGMMV全基因組序列及結構

CGMMV為正單鏈線狀RNA病毒,病毒粒體為桿狀,大小為300×18 nm［25］。截止到2015年9 月17日,共有42個CGMMV分離物的全基因組序列提交到NCBI GenBank中,基因組大小約6.4 kb (6 325～6 425 bp) (表1),寄主包括西瓜、黃瓜、瓠瓜、南瓜、甜瓜、絲瓜和本氏煙草,分離物來源于日本、韓國、西班牙、俄羅斯、印度、以色列,以及中國臺灣、海南、遼寧、山東、河南、浙江等多個國家和地區(qū)。利用MEGA 5.10軟件對42個CGMMV的核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現,這42個分離物按照親緣關系遠近聚為2個基因型:亞洲類型和歐洲類型(圖1)。其中來源于中國、韓國、日本、以色列、印度和加拿大的38個CGMMV分離物歸到亞洲類型; SP,MC-1,MC-2 和VIROG-43M來源于西班牙和俄羅斯,屬于歐洲類型。

CGMMV病毒含有5′端和3′端2個非編碼區(qū),5′端含有帽子結構,3′端有1個可接受組氨酸相似于tRNA狀的結構［1］。帽子結構具有加強外殼蛋白翻譯的穩(wěn)定性,使其不易被降解［26］。CGMMV編碼區(qū)包含4個開放閱讀框,分別編碼129 /186 ku,29 ku和17.3 ku蛋白［27］。其中,186 ku蛋白是由129 ku蛋白的開放讀碼框終止子通讀產生的,186 ku和129 ku蛋白均與病毒復制有關,被稱為RNA依賴性聚合酶蛋白［27］。29 ku蛋白為運動蛋白,協(xié)助病毒在細胞間移動［28］。17.3 ku蛋白為外殼蛋白,作為病毒粒子的重要的結構亞基,保護核酸并協(xié)同介導病毒的長距離運輸［29］。

表1　GenBank中CGMMV全基因組序列信息

3　CGMMV的檢測方法

CGMMV的檢測技術有很多,包括生物學檢測、電子顯微鏡技術、血清學檢測、PCR檢測和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,FISH)檢測等。

圖1　CGMMV核苷酸序列的系統(tǒng)進化分析

3.1生物學檢測

生物學檢測鑒定是植物病毒檢測的傳統(tǒng)技術,是其他檢測方法的重要基礎,為植物病毒病原診斷提供了一定的幫助。秦碧霞等［30］在同一溫室中分離的病毒分離物不侵染莧色藜,但可在曼陀羅上產生局部褪綠斑,由此認為分離到CGMMV的另一個株系。黃靜［31］取黃瓜病葉進行摩擦接種,其中黃瓜、南瓜、葫蘆和西瓜癥狀表現為系統(tǒng)侵染,而莧色藜發(fā)病遲緩,出現紅色斑點,曼陀羅上無癥狀,由此認為該病毒分離物可能屬于日本西瓜株系。李海明等［32］將CGMMV分離物進行生物學鑒定,在葫蘆科植物和莧色藜上均表現出發(fā)病癥狀,在黃瓜、南瓜、芋瓠、甜瓜上主要表現為系統(tǒng)花葉和有褪綠斑;而在莧色藜上表現為局部白色枯斑。接種結果初步表明,CGMMV-GX屬于西瓜株系。雖然鑒別寄主或指示植物在植物病毒的生物學檢測鑒定方面應用廣泛,但存在時間長、易受環(huán)境和季節(jié)影響等限制,需要與其他檢測方法結合才能得到較可靠的結果。

3.2電鏡檢測

電鏡檢測方法可直觀顯示病毒粒子的形態(tài)結構、病毒在寄主細胞內的存在狀態(tài)、寄主細胞的結構變化等［33］。對沙特阿拉伯CGMMV的1個株系應用負染色方法進行鑒定,觀察到侵染葫蘆的CGMMV粒體形狀為直桿狀,大小為300～325 nm［19］。黃靜［31］對接種CGMMV后的黃瓜病葉浸漬液經2%的磷鎢酸負染后用透射電鏡觀察,觀察到直桿狀的病毒粒子,長度大約為300 nm,寬度大約為18 nm,與CGMMV病毒的典型粒子具有相同的形態(tài)。Shang等［34］對純化后的CGMMV病毒顆粒進行電鏡觀測,發(fā)現典型的桿狀病毒顆粒。Liu等［35］對接種CGMMV后的黃瓜葉片進行電鏡檢測,發(fā)現典型的大小為300×18 nm的桿狀CGMMV病毒顆粒。利用光學相干斷層成像術(optical coherence tomography,OCT),將感染CGMMV的黃瓜種子與健康種子進行鑒定,發(fā)現感病的種子種皮與胚乳之間存在窄間隙,而健康的種子中則不存在該間隙,進而將感病種子與健康種子區(qū)分［36］。由于電鏡檢測具有形態(tài)觀察的直觀性,對植物病毒的檢測鑒定起到了較好的輔助鑒定作用。

3.3血清學檢測

檢測植物病毒的血清學方法較多,依據的原理都是基于構成不同病毒蛋白抗原決定簇的差異與相應抗體的特異性結合。目前,在CGMMV的檢測上應用最多的是酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)。使用改良的ELISA (M-ELISA)技術檢測黃瓜種子是否帶有CGMMV病毒,結果從800粒黃瓜種子中檢測出1粒帶毒種子［37］。利用ACP-ELISA和TASELISA技術對CGMMV病毒進行檢測,其中ACPELISA可檢測到0.16 ng的純化病毒,而TASELISA可檢測到至少0.04 ng的病毒［34］。血清學方法由于操作簡單,結果準確,被廣泛應用于各種病毒的檢測,較適合田間大規(guī)模的鑒定。

3.4PCR檢測

隨著分子生物學的迅猛發(fā)展,尤其是PCR技術的成熟,為黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測提供了更為靈敏高效的技術方法,包括RT-PCR,real-time PCR和IC-RT-PCR。目前,應用較多的是RT-PCR技術。Liu等［35］利用CGMMV的CP蛋白基因序列設計引物,對接種后的黃瓜葉片、花和種子進行RT-PCR檢測證明,CGMMV既可以通過受精的花朵進行水平傳播,也可通過種子橫向傳播到下一代。另外,將PCR技術和熒光測定相結合的realtime PCR不僅可避免假陽性的出現,而且可提高檢測的靈敏度,進行定量檢測。Chen等［38］利用多引物系統(tǒng)并結合靶向CGMMV 3’非編碼區(qū)的TaqMan探針,即real-time TaqMan RT-PCR技術,對在中國搜集到的CGMMV的分離物進行檢測,可在黃瓜中檢測到至少0.13 pg的CGMMV。免疫捕捉RT-PCR (IC-RT-PCR)是1種抗原檢測系統(tǒng),將1段已知序列DNA片段標記到抗原抗體復合物上,再用PCR方法將這段序列擴增,然后用常規(guī)PCR方法檢測產物［10］。黃靜［31］利用IC-RT-PCR技術,在接種后的黃瓜病葉、葫蘆病葉、南瓜病葉和莧色藜枯斑均得到與預期大小相一致的目的條帶。Shang等［34］利用IC-RT-PCR技術可檢測到0.1 pg的病毒含量,靈敏度極高。PCR檢測技術由于靈敏度高,結果可靠,已作為一種常規(guī)的檢測方法,對CGMMV病情的控制和預防起到重要的作用。

3.5FISH檢測

FISH的基本原理是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析［39］。FISH已應用于番茄金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)［40］、番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和馬鈴薯葉片卷曲病毒(Potato leafroll virus)的檢測［41］。利用FISH技術在黃瓜和甜瓜的雄花中進行CGMMV的檢測發(fā)現,花藥組織被CGMMV感染,而花粉顆粒未被感染,該發(fā)現對于CGMMV的防治,特別通過種子的病毒傳播具有重要的流行病學意義［42］。

4　葫蘆科CGMMV抗性的遺傳分析

目前,對CGMMV抗性的遺傳分析研究還較少。通過對R×R,R×MR,R×S,MR×MR,MR×S和S×S等抗性不同的15個甜瓜組合配置六世代(P1,P2,F1,F2,BC1和BC2)進行遺傳分析,發(fā)現CGMMV的抗性遺傳主要由多基因控制并呈現隱性遺傳特點,感病對抗病表現為不完全顯性;在這15個組合中,有10個組合存在互作;除Phoot×Harela外,所有存在互作的組合表現為重復上位作用; Kachri×Phoot (R×R)在F1表現為雜種優(yōu)勢,F2表現為超親分離［43］。CGMMV抗性的雜種優(yōu)勢為配置雜交組合提高抗病性提供了基礎和依據。

5　葫蘆科CGMMV抗性的遺傳改良

5.1抗性材料篩選及種間雜交

通過對現有葫蘆科栽培種和野生種進行接種鑒定,篩選具有抗(耐) CGMMV的種質資源。Rajamony等［44］鑒定到4份CGMMV抗性的甜瓜材料,其中,Phoot和Kachri為非沙漠類型,FM-1和FM-5為育種株系。對72份遺傳背景差異較大的甜瓜材料采用人工摩擦接種的方法進行苗期CGMMV抗性鑒定,共鑒定到2份免疫材料(C.figarei和C.zeyheri)和8份高抗材料(PRM-6,FM1,Phoot,VRM-5-10A,VRM-5-10B,VRM-7-12A,VRM-31-1-2和VRM-29-1C)［45］。Mitsuhiro等［46］對主要來源于亞洲的20份甜瓜材料進行CMV-B2和CGMMV-K摩擦接種,并結合DAS-ELISA檢測發(fā)現,其中4份材料抗CMV,未檢測到抗CGMMV的材料。這些研究為葫蘆科作物CGMMV抗原的尋找和篩選提供了參考。

由于野生材料具有栽培品種所不具備的重要特性,材料之間的遠緣雜交對于品系的遺傳改良至關重要。C.anguria和C.zeyheri均屬于甜瓜亞屬野生種,對CGMMV表現為抗性［47］。利用C.anguria 和C.zeyheri種間雜交,選育抗CGMMV的品種［48］。Skálová等［49］通過胚和種子挽救技術,獲得C.anguria和C.zeyheri的種間雜交植株。種間雜交為CGMMV抗性材料的獲得提供了基礎。

5.2基于基因工程的遺傳改良

轉錄后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)或RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA (dsRNA)啟動的序列特異的mRNA降解過程［50］。長鏈dsRNA被內切酶切成小的干擾RNA (small interfering RNA,siRNA)［51］。這些siRNA形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC),進而識別其互補的RNA并將其降解［52］。這種轉錄后基因沉默機制可被病毒誘導,形成siRNA介導的病毒防御機制［53-54］。因此,將編碼病毒特異序列的dsRNA轉入寄主中可以誘導病毒產生RNA沉默,進而提高寄主的抗性［55］。

植物病毒早期的轉基因抗性植物多數是利用病毒的外殼蛋白。通過農桿菌介導法將病毒的外殼蛋白(CGMMV-CP)轉入西瓜的砧木中,部分西瓜轉基因植株對CGMMV表現為抗性［56］。將西瓜銀色斑點病毒(watermelon silver mottle virus,WSMoV)的部分N端序列與黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)、西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus,WMV)的部分CP基因序列融合成嵌合載體,通過農桿菌介導法轉入西瓜,其中2個株系對CMV,CGMMV和WMV均表現為抗性［57］。此外,運動蛋白基因也被用于培育抗CGMMV病毒的轉基因植物。將CGMMV運動蛋白基因的重復序列(DR-MP)在甜瓜中過表達,轉基因植株對CGMMV表現出較高的抗性,并且轉基因植物基因組DNA的胞嘧啶出現甲基化的現象［58］。除外殼蛋白和運動蛋白外,復制酶基因也被用于培育抗病毒植物。將含有缺陷CMV的復制酶基因的反向重復序列轉化煙草,轉基因植株產生有效的CMV抗性,并且在轉基因植株接種病毒前后均有siRNAs的存在,表明抗性的產生是由RNA沉默導致的［59］。目前,還未見復制酶基因在葫蘆科植物應用提高CGMMV抗性的相關報道。

5.3基于miRNAs測序和人工miRNAs的遺傳改良

miRNAs測序技術可獲得數以百萬計的讀數,使其成為揭示miRNAs表達模式、鑒定低表達量及特異miRNAs的有效途徑。對接種CGMMV后10,30和50 d的黃瓜葉片進行小RNA測序,鑒定到可能與CGMMV的脅迫響應相關的8個novel miRNAs 和15個已知miRNAs。其中miRNA156通過調控其靶基因Csa6M091970.2和Csa6M091970.1參與微生物脅迫、信號轉導和細胞發(fā)育等過程; miR390 在CGMMV侵染過程中表達的延遲黃瓜的開花時間,進而影響果實的發(fā)育;此外,miR171c,miR172d和miR2673也與CGMMV的脅迫響應有關［60］。這些小RNA及其靶基因為植株抗病性的改良提供了線索和基礎。

人工miRNA (artifical microRNA)技術是利用內源miRNA前體骨架,通過替換miRNA序列產生具有新功能的miRNA［61］。除調控內源基因的表達外,人工miRNAs還可抵抗病毒的侵染。利用人工miRNA沉默蕪菁黃化花葉病毒(TYMV)的沉默抑制蛋白P69和蕪菁花葉病毒(TuMV)的沉默抑制蛋白HC-Pro,轉基因擬南芥對蕪菁黃化花葉病毒和蕪菁花葉病毒具有高水平抗性［62］。煙草中表達針對黃瓜花葉病毒(CMV)的2b蛋白的人工miRNA表現出對CMV的抗性,其抗性水平超過siRNA介導的抗病毒水平［63］。張曉輝［64］通過設計識別CMV的2a/2b區(qū)和基因組的3’UTR的2個人工miRNAs并在番茄中過表達,轉基因番茄植株表現出高水平的CMV抗性,通過嫁接和多重病毒復合侵染試驗表明抗性是持續(xù)穩(wěn)定的,且通過嫁接試驗證明,人工miRNAs是一種細胞自主性的抗病毒分子。這為通過人工miRNA在葫蘆科植物中進行抗CGMMV的研究提供了很有意義的參考。

6　問題和展望

目前,對于葫蘆科作物CGMMV抗性的遺傳改良雖然取得一定進展,但仍存在較多的問題,如可直接用于育種的抗源材料較少;對CGMMV抗性遺傳規(guī)律的研究不深入;缺少CGMMV抗性基因的定位和用于輔助選育的分子標記;基因工程主要利用CGMMV病毒的衣殼蛋白和運動蛋白,而對于抗病機制仍不甚明確。針對這種現狀,提出以下建議:加快對葫蘆科作物CGMMV抗源材料的篩選,并利用遠緣雜交技術將抗性基因轉入到育種材料中;開展葫蘆科作物抗CGMMV QTLs定位和分子標記開發(fā),分子標記作為輔助選擇手段,可以提高抗病品種的選擇效率;進行葫蘆科作物抗CGMMV的基因克隆,明確抗病的分子機制,并利用基因工程將抗性基因轉移到農學性狀優(yōu)良的品種上。此外,還可利用組學如轉錄組、蛋白組學和miRNAs測序等技術和方法進行CGMMV的抗性改良。

除了利用傳統(tǒng)育種及分子育種對葫蘆科作物CGMMV抗性進行遺傳改良之外,還需加強對CGMMV的預防和控制,如生產無病種子,加強種子檢疫、種子除害處理,做好田間管理和藥劑防治、土壤消毒及輪茬種植等策略,避免CGMMV的傳播和擴散。

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(責任編輯：張瑞麟)

通信作者:范 敏,E-mail:fanminfm@sina.com。

作者簡介:孫玉燕(1986—),女,山東菏澤人,助理研究員,博士,研究方向西甜瓜遺傳育種,E-mail:syy1111@126.com。

基金項目:國家自然科學基金(31572145; 31272188; 31301787);浙江省農業(yè)新品種選育重大科技專項(2012C12903-2-10)

收稿日期:2015-12-16

中圖分類號：S436.42

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017(2016)02-0240-08

文獻著錄格式:孫玉燕,牛曉偉,范敏.黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV及葫蘆科作物抗性遺傳改良研究進展［J］.浙江農業(yè)科學,2016,57 (2):240-247.