■季旭黃權(quán)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

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魚類卵黃蛋白和卵黃蛋白原的研究進(jìn)展

■季旭黃權(quán)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

摘要：卵黃蛋白是魚卵中的主要成分，卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體。卵黃蛋白作為魚類胚胎發(fā)育和卵黃囊期仔魚的主要內(nèi)源性營養(yǎng)，對魚類的繁殖和生長有著重要的意義。目前對不同魚的卵黃蛋白或卵黃蛋白原的研究大體分為：分離純化、電泳性質(zhì)分析、酶聯(lián)免疫吸附檢測試驗(yàn)等。文章介紹了卵黃蛋白原的組成、營養(yǎng)、代謝規(guī)律、分離純化方法、常用檢測方法等，為進(jìn)一步研究魚類早期營養(yǎng)提供參考。

關(guān)鍵詞：魚類；卵黃蛋白；卵黃蛋白原

卵黃蛋白(Vitellin)是由卵黃蛋白原通過血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)铰殉步?jīng)過加工修飾形成的。仔魚開口攝食前完全依靠體內(nèi)殘余的卵黃為生，所以卵黃蛋白的數(shù)量和質(zhì)量對魚類早期的存活、生長和發(fā)育有著至關(guān)重要的影響。卵黃蛋白原(Vitellogenin，簡寫Vg)是卵生脊椎動物體內(nèi)一種高分子量磷酸脂糖蛋白，具有種間差異性，是卵黃蛋白的前體。魚類卵黃蛋白原是在卵黃生成期雌魚分泌雌性激素誘導(dǎo)肝細(xì)胞形成的，在卵巢中降解成卵黃磷脂蛋白、卵黃高磷蛋白和β’-組分。由于在雄魚和幼魚肝臟也有雌激素受體，所以在外源雌激素或者雌激素類似物的誘導(dǎo)下，雄魚和幼魚也能分泌卵黃蛋白原，這種特性使卵黃蛋白原成為篩選化學(xué)物質(zhì)是否具有環(huán)境雌激素效應(yīng)的生物標(biāo)志物，可以評價(jià)水環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物的污染狀況。本文綜述了卵黃蛋白和卵黃蛋白原最新研究進(jìn)展。

1卵黃的組成

卵黃的組成成分包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、游離脂肪酸、核苷酸和核酸等物質(zhì)，魚類卵黃的主要成分是卵黃蛋白（卵黃球）和脂肪（油球），是魚類胚胎發(fā)育和卵黃囊期仔魚發(fā)育的主要內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)。眾多學(xué)者通過對不同魚類雌性蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，魚類卵黃蛋白和卵黃蛋白原具有相同的亞基，都含有糖、脂、磷，是一種糖磷脂蛋白，具有明顯的種特異性。魚類的卵黃蛋白原通常是以2個150~220 kD的同源二聚體組成。

2卵黃蛋白的發(fā)生及代謝規(guī)律

目前對卵黃蛋白的研究主要是對卵黃蛋白和卵黃蛋白原的定性和定量研究上，研究內(nèi)容大多是：卵黃蛋白的分離純化（卵黃蛋白原的誘導(dǎo)、分離純化）—電泳性質(zhì)鑒定—建立Elisa方法檢測卵黃蛋白或卵黃蛋白原含量的變化，研究卵黃蛋白和卵黃蛋白原的合成機(jī)制和代謝過程。

研究表明，卵黃蛋白的合成方式主要包括內(nèi)源性卵黃合成和外源性卵黃合成。內(nèi)源性卵黃主要是早期卵母細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中產(chǎn)生和積累形成。外源性卵黃則是在卵細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行合成前體物質(zhì)后再運(yùn)送到卵內(nèi)形成卵黃蛋白的。大部分動物如脊椎動物和昆蟲的卵黃有兩種來源，少部分只有一種來源，如多毛綱的巢沙蠶的卵黃是由卵母細(xì)胞內(nèi)的高爾基體合成，甲殼類河蝦的卵黃蛋白原是由卵母細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成。魚類的卵黃蛋白主要依賴于外源性卵黃合成。

外源性卵黃運(yùn)送到卵母細(xì)胞中主要有兩種方式，一種是卵母細(xì)胞以胞飲方式從血淋巴中攝入卵黃蛋白原，另一種是卵黃蛋白原通過濾泡細(xì)胞被間接吸收。已有研究發(fā)現(xiàn)，長毛對蝦和羅氏沼蝦的濾泡細(xì)胞能夠向卵母細(xì)胞提供大量卵黃蛋白原。王浩等通過對大阪鯽魚研究發(fā)現(xiàn)，其肝細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中都有卵黃磷脂蛋白。堵南山等研究中華絨螯蟹發(fā)現(xiàn)，其肝胰腺產(chǎn)生的卵黃蛋白先進(jìn)入血淋巴中而后被卵母細(xì)胞吸收。

卵黃蛋白和卵黃蛋白原在魚類體內(nèi)的變化都是有規(guī)律的，大體上都是在生殖期產(chǎn)孵前達(dá)到高峰。王鳳等通過檢測人工養(yǎng)殖哲羅鮭生殖周期中血清卵黃蛋白原濃度變化發(fā)現(xiàn)，哲羅鮭血清Vg濃度在產(chǎn)孵后5~8月內(nèi)較低，6月降至最低值，隨后9~12月濃度迅速上升，12月升到最高，臨近產(chǎn)孵的2、3月下降，4月催產(chǎn)排卵時濃度降低，總體來說在卵巢發(fā)育處在第Ⅳ期時Vg濃度出現(xiàn)一個高峰。張艷珍等通過檢測中華鱘血清中磷的含量來計(jì)算Vg含量，研究發(fā)現(xiàn)，中華鱘雌性個體的Vg含量在卵巢發(fā)育Ⅱ期后呈上升趨勢，Ⅱ~Ⅲ期之間增加的速率比Ⅲ~Ⅳ期快，Ⅴ期間時Vg含量最高。Chang等對羅氏沼蝦的研究發(fā)現(xiàn)，卵黃蛋白在成熟的卵母細(xì)胞中大量存在，其含量隨著卵母細(xì)胞的成熟而逐漸增多，隨胚胎發(fā)育而減少，血淋巴中的卵黃蛋白原隨卵母細(xì)胞的發(fā)育而逐漸增加，產(chǎn)卵后卵黃蛋白原突然下降并保持在低水平。

3卵黃蛋白的營養(yǎng)和生理功能

魚卵中的主要成分就是卵黃蛋白，含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、鈣、磷、鐵、維生素、微量元素和不飽和脂肪酸等，是魚類胚胎發(fā)育和早期仔魚必要的營養(yǎng)物質(zhì)。在孵化后的一段時間內(nèi)，仔魚都完全依賴剩余的卵黃蛋白維持生命直至卵黃蛋白耗盡，卵黃蛋白屬于內(nèi)源營養(yǎng)，在最開始的24 h內(nèi)主要用于魚體的迅速生長和旺盛的新陳代謝,之后則主要用于器官分化和運(yùn)動，所以卵黃蛋白對魚類來說十分重要。Montorzi等研究證明，爪蟾卵黃蛋白原能夠結(jié)合鈣離子、鋅離子、鎳離子等金屬離子并將它們運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞中，鋅離子與脂磷蛋白結(jié)合，鈣離子與高磷蛋白結(jié)合。Komat?su等發(fā)現(xiàn)，鰲蝦和鰻魚的卵黃蛋白都有潛在的鈣離子依賴型的蛋白酶活性。

卵黃蛋白不僅為魚類提供早期發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、脂肪、維生素、碳水化合物、硫、磷等，還能夠攜帶、轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪。卵黃蛋白原不僅能夠轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子，還能夠轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素、維生素A、核黃素和類胡蘿卜素到卵母細(xì)胞，并且促進(jìn)培養(yǎng)中的卵母細(xì)胞的生長、分化。宋洪建等通過研究大馬哈魚卵黃囊期仔魚的異速生長及器官優(yōu)先發(fā)育，發(fā)現(xiàn)卵黃為仔魚存活起著重要作用的器官的發(fā)育提供了必需的營養(yǎng)物質(zhì)，這對于仔魚早期發(fā)育、避免早期死亡有著重要意義。劉榮臻等通過對試驗(yàn)魚腹腔注射卵巢中提取的雌性蛋白發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)性腺的成熟，提高產(chǎn)卵率、受精率、孵化率、魚苗孵化率以及魚苗成活率，增強(qiáng)親魚和仔魚的生活力，使親魚產(chǎn)卵順利。李兆杰對魚類卵黃蛋白原的免疫功能研究首次發(fā)現(xiàn)，卵黃蛋白原能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的噬菌功能，并闡明了卵黃蛋白原一些免疫功能的機(jī)理。

4卵黃蛋白原和卵黃蛋白制備

實(shí)驗(yàn)室通常是對實(shí)驗(yàn)魚靜脈注射雌激素或者雌激素類似物對其誘導(dǎo)產(chǎn)生卵黃蛋白原。Mitsui等運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測了幾種激素對卵黃蛋白原的誘導(dǎo)活性，由強(qiáng)到弱分別為：己烯雌酚(DES)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、雌酮(E1)、α-雌二醇(α-E2)、植物雌激素(GEN)、雙酚A(BPA)、壬基酚(NP)、辛基酚(OP)。多數(shù)學(xué)者通過17β-雌二醇，也有學(xué)者注射17α-乙炔基雌二醇或用浸浴法（小型魚類）誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生卵黃蛋白原，卵黃蛋白的制備通常是對實(shí)驗(yàn)魚體卵巢粗提液或整體勻漿（小型魚類）進(jìn)行分離純化獲得卵黃蛋白。目前，學(xué)者已經(jīng)用17β-雌二醇誘導(dǎo)劍尾魚、金魚、瓦氏黃顙魚、唐魚、美國紅魚等許多魚類產(chǎn)生卵黃蛋白原，進(jìn)而對不同魚類的卵黃蛋白原的理化性質(zhì)做了研究。

5卵黃蛋白原和卵黃蛋白的分離純化方法

目前，卵黃蛋白原和卵黃蛋白的純化方法有選擇性沉淀法、密度梯度離心法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法和結(jié)合聚丙烯酰胺電泳法。實(shí)驗(yàn)常采用凝膠過濾層析法與離子交換層析法結(jié)合來提高Vg純化效果?，F(xiàn)在有若干魚的Vg被純化、性質(zhì)鑒定。Franc?ois Brion等利用離子交換層析法和分子篩凝膠過濾層析法分離提純了犬首鮈和鰱魚的卵黃蛋白原，其分子量為435 kD和424 kD。吳翠琴等利用分子篩和離子交換兩步法分離純化了真鯛的Vg，發(fā)現(xiàn)其分子量大約為450 kD，并具有兩條分子量，分別為170 kD和120 kD的亞基。梁勇等利用陰離子交換介質(zhì)和液相層析技術(shù)對鯉和團(tuán)頭魴的Vg研究表明，鯉的Vg可能由170 kD和165 kD亞基組成，團(tuán)頭魴的Vg由兩個大小相同為150 kD亞基組成，這也證明了卵黃蛋白原的種特異性。李穎等利用凝膠過濾層析技術(shù)分離純化了美國紅魚的Vg，計(jì)算出美國紅魚兩種卵黃蛋白原的分子量和其3種亞基的分子量，表明不同于淡水魚只有一種Vg，某些海水魚的Vg可能有兩種形式。李育培等采用凝膠過濾和離子交換層析技術(shù)分離純化出瓦氏黃顙魚的Vg，計(jì)算出其分子量約為240 kD，并測定只有一個143 kD的亞基，推測其為兩個相同亞基構(gòu)成的同源二聚體。姚靜等采用選擇性沉淀法和陰離子交換層析法分離純化了唐魚的Vg，并計(jì)算出其分子量為440 kD。選擇沉淀法具有很多優(yōu)點(diǎn)，它耗時短、操作簡便，不需要特殊設(shè)備，一次能夠處理大量樣品，而且容易保持低溫條件下操作，但是缺點(diǎn)是影響沉淀效果的因素比較多，如血漿Vg水平低可能無法形成沉淀，溶液中溶劑的比例也影響能否生成沉淀，而且蛋白質(zhì)的分子量極性和沉淀劑的濃度都對沉淀效果有影響。密度梯度離心法因其程序較為繁瑣、沉淀效果重復(fù)性差等不足應(yīng)用較少，而凝膠過濾層析法和離子交換層析法結(jié)合具有操作簡單，蛋白純化重復(fù)性好、并且可以反復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白純化中。

6卵黃蛋白原的Elisa檢測

表1魚類卵黃蛋白和卵黃蛋白原及其分離純化方法研究進(jìn)展

檢測Vg含量的方法有很多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法、蛋白質(zhì)免疫印跡法、放射性免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫、熒光免疫法等。由于Elisa方法具有特異性強(qiáng)、操作簡便易用、靈敏度高又沒有同位素污染的優(yōu)點(diǎn)，很多研究者都采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)來進(jìn)行定量測定（見表1）。姚靜等利用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測了不同環(huán)境內(nèi)分泌干擾物濃度下雄性唐魚分泌的Vg含量；李育培等利用間接法測定了瓦氏黃顙魚體內(nèi)Vg的含量；L. B. Christiansen等用夾心法檢測了不同外源化合物刺激下未成熟虹鱒體內(nèi)Vg的含量；王鳳等建立了夾心酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測人工養(yǎng)殖哲羅鮭一個生殖周期Vg的含量變化，表明了人工養(yǎng)殖條件下生殖周期為一年產(chǎn)孵前Vg含量最高；黃權(quán)等建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測黃顙魚仔魚卵黃蛋白含量的變化，結(jié)果表明，破膜96 h卵黃蛋白含量逐漸下降消失，此時適宜投喂生物餌料；溫茹淑等利用間接法檢測不同質(zhì)量濃度的17-β雌二醇對劍尾魚雄魚誘導(dǎo)產(chǎn)生Vg的含量，結(jié)果表明，50 μg/l E2誘導(dǎo)其產(chǎn)生Vg的效果明顯。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可以利用同一酶標(biāo)抗體檢測相應(yīng)抗體，但是其能否成功的關(guān)鍵在于抗原的純度，若抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因?yàn)楦偁幬蕉绊懓恍Ч８偁幏ǖ膬?yōu)點(diǎn)在于其快速方便，只有一次保溫洗滌過程，但其需要較多的酶標(biāo)記抗原。夾心法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，但缺點(diǎn)是不能檢測小分子抗原及半抗原。

7　展望

卵黃蛋白原是大多數(shù)卵生動物卵黃蛋白的前體，卵黃蛋白是胚胎發(fā)育的內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)在生產(chǎn)上常為仔魚開口飼喂雞蛋黃、鴨蛋黃或豆?jié){，因此筆者猜測這是否與卵黃蛋白對仔魚生長發(fā)育的促進(jìn)作用有關(guān)。卵黃蛋白原在環(huán)境雌激素誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生，因此卵黃蛋白原是用于環(huán)境變化和檢測的標(biāo)志物。近年來很多魚類人工繁殖率由于環(huán)境溫度、近親繁殖等因素下降，因此卵黃蛋白原的研究對了解胚胎發(fā)育有著重要意義，并且為進(jìn)一步了解其繁殖率下降的原因提供理論基礎(chǔ)。研究卵黃蛋白原與卵黃蛋白在數(shù)量上是否有相關(guān)性以及卵黃蛋白原數(shù)量與激素分泌和性成熟之間的關(guān)系也能夠幫助人們解決魚類人工繁殖上的一些問題。通過對卵黃蛋白和卵黃蛋白原的研究可以為深入了解內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)與仔魚開口攝食生態(tài)連續(xù)性問題提供依據(jù)。

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（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）

Research progress of fish vitellin and vitellogenin

Ji Xu, Huang Quan

Abstract：Vitellin is the main component in fish egg. Vitellogenin is the precursor of vitellin. The vitel?lin as the main endogenous feeding fish embryo and yolk sac larvae is of great significance to the growth and reproduction of fish. Present study of different fish vitellin or vitellogenin are generally di?vided into: separation and purification, electrophoresis analysis of properties, enzyme linked immuno?sorbent assay. This article introduces the vitellogenin composition, nutritional, metabolic rule, separa?tion and detection methods commonly used purification method, etc.

Key words：fish；vitellin；vitellogenin

收稿日期：2015-12-27

通訊作者：黃權(quán)，副教授，碩士生導(dǎo)師。

作者簡介：季旭，碩士，研究方向?yàn)樗鷦游餇I養(yǎng)。

中圖分類號：S963

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）04-0032-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.008