■劉亦娟孫金生，2包海巖張　勤臧　莉徐曉麗

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津300221；3.天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津300221）

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魚(yú)類(lèi)病原菌三聯(lián)體檢測(cè)試紙的制作與應(yīng)用

■劉亦娟1孫金生1，2包海巖3張勤3臧莉3徐曉麗3

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津300221；3.天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津300221）

摘要：試驗(yàn)分別制作柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌3種病原菌的膠體金免疫層析試紙條，將其組裝成三聯(lián)體卡條，用于3種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)病原菌的平行檢測(cè)。結(jié)果表明，所制作的三聯(lián)體檢測(cè)試紙具有較好的特異性，與其它魚(yú)類(lèi)病原菌無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)柱狀黃桿菌的檢測(cè)靈敏度為3×106cfu/ml，對(duì)嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌的檢測(cè)靈敏度均為3×105cfu/ml。將三聯(lián)體檢測(cè)試紙用于生產(chǎn)上魚(yú)類(lèi)病原菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的符合率在87.7%以上。操作簡(jiǎn)便快速，一次制樣可同時(shí)檢測(cè)3種病原菌，5~ 10 min即可得到檢測(cè)結(jié)果，提高了檢測(cè)效率，適合基層生產(chǎn)推廣應(yīng)用及大量樣本的快速篩查。

關(guān)鍵詞：柱狀黃桿菌；嗜水氣單胞菌；海豚鏈球菌；免疫層析試紙條；三聯(lián)體檢測(cè)試紙

細(xì)菌性疾病是魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中的最常見(jiàn)也是危害最大的一類(lèi)疾病，病原菌種類(lèi)較多，危害嚴(yán)重，如由柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)引起的細(xì)菌性爛鰓病、由嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）引起的細(xì)菌性敗血癥以及由鏈球菌引起的鏈球菌病，一旦發(fā)生，可在短期內(nèi)造成很高的水生動(dòng)物死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于魚(yú)類(lèi)細(xì)菌病的防治，使用抗生素仍是目前生產(chǎn)中使用的主要手段，但治療效果并不理想，不僅提高了養(yǎng)殖成本，還帶來(lái)一系列的負(fù)面影響。因此應(yīng)對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)菌病，日常消毒、早期預(yù)防以及有效的檢測(cè)診斷、對(duì)癥施治尤為重要。對(duì)細(xì)菌病的檢測(cè)診斷，實(shí)驗(yàn)室多采用細(xì)菌分離鑒定法及PCR法來(lái)對(duì)病原菌做準(zhǔn)確的鑒定，并通過(guò)藥敏分析篩選敏感藥物指導(dǎo)生產(chǎn)，針對(duì)性較好，但耗時(shí)長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室及操作人員。養(yǎng)殖生產(chǎn)中則主要依靠技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)，具體病原菌并不十分確切，用藥存在盲目性，且多數(shù)細(xì)菌性疾病為多種病原菌混合感染導(dǎo)致，不同細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性不同，所使用的藥物與治療方法也不盡相同。養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟需一種適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性病原菌的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)，以及早確定病原菌，采取有效措施控制病害發(fā)生，為養(yǎng)殖生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

膠體金免疫層析試紙是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種新型的體外診斷技術(shù)產(chǎn)品，具簡(jiǎn)便快速、靈敏準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，不需要專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前，膠體金免疫層析試紙?jiān)卺t(yī)學(xué)及畜牧疾病檢測(cè)領(lǐng)域已有較多的應(yīng)用，如檢測(cè)乙肝病毒、豬鏈球菌Ⅱ型、金黃色葡萄球菌、H5、H9亞型禽流感病毒、犬弓形蟲(chóng)等的試紙條[1-4]。在水產(chǎn)病原菌生物檢測(cè)領(lǐng)域，已分別建立了用于檢測(cè)溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、對(duì)蝦白斑病病毒[5-9]等的免疫層析試紙條，均針對(duì)于某一種病原菌進(jìn)行檢測(cè)。本研究制作了柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌、海豚鏈球菌的免疫層析試紙條，并將其組裝成三聯(lián)檢測(cè)試紙，用于3種魚(yú)類(lèi)病原菌的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)篩查，也為水產(chǎn)動(dòng)物疾病的系統(tǒng)診斷提供參考。

1　材料

1.1儀器與試劑

18~20 nm膠體金溶液、硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維、吸水紙、PVC板均購(gòu)自上海杰一生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、蔗糖購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；單維往復(fù)劃膜儀購(gòu)自上海金標(biāo)公司，細(xì)菌比濁儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司。

1.2菌株來(lái)源

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、柱狀黃桿菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)、魚(yú)腸道弧菌(Vibrio ichthyoenteri）、鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia serio?lae）、無(wú)乳鏈球菌（S. agalactiae）、鰻利斯頓氏菌（Lis?tonella anguillarum）、遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella starda）、哈維氏弧菌（V.harveyi）由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，類(lèi)志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）、弗尼斯弧菌（V.furnissii）、維氏氣單胞（A.veronii）、嗜水氣單胞菌由天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

2試驗(yàn)方法

2.1細(xì)菌抗體的制備

取海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌分別免疫新西蘭白兔，得到兔抗海豚鏈球菌、兔抗柱狀黃桿菌、兔抗嗜水氣單胞菌3種抗血清，采用Protein A親和層析法純化所得到的抗血清，間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，-80℃保存。

2.2金標(biāo)抗體的制作

2.2.1最適標(biāo)記pH值的確定

用0.01 mol/l K2CO3將膠體金溶液調(diào)至6.0~10.0不同的pH值梯度。取不同pH值的膠體金溶液各1 ml，分別加入抗海豚鏈球菌抗體（抗柱狀黃桿菌抗體或抗嗜水氣單胞菌抗體）10 μg，振蕩混勻后靜置30 min，加入100 μl 10%的NaCl溶液混勻靜置4 h，觀察每管顏色變化，以顏色保持不變的pH點(diǎn)作為最佳標(biāo)記pH值。

2.2.2最適標(biāo)記蛋白量的確定

用0.01 mol/l K2CO3將膠體金溶液調(diào)至最適pH值，取6支EP管，每管各加入膠體金溶液1.0 ml，每管分別再加入1、5、10、15、20、25 μg的抗海豚鏈球菌抗體（抗柱狀黃桿菌抗體或抗嗜水氣單胞抗體）使其形成不同濃度梯度，混勻后靜置30 min，加入100 μl 10%的NaCl溶液混勻靜置4 h，觀察每管顏色變化，將顏色變化最小一組的抗體標(biāo)記濃度作為最佳標(biāo)記濃度，工作濃度則選擇最佳標(biāo)記濃度高一個(gè)級(jí)別的濃度。

2.2.3金標(biāo)抗體的制備與純化

將膠體金溶液調(diào)至最適標(biāo)記pH值，加入最適標(biāo)記濃度的待標(biāo)記抗體，混勻后靜置；加入5%的BSA使其加入后終濃度為1%，混勻，將初步制得的金標(biāo)抗體溶液4 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液于13 500 r/min、4℃離心30 min棄上清，沉淀用金標(biāo)抗體洗滌液（含1% BSA的PBS）洗滌2次后，用金標(biāo)抗體保存液（含1% BSA，2%蔗糖，0.1% Tween-20的PBS）重懸保存于4℃。

2.3膠體金墊的制備

將純化后的金標(biāo)抗體均勻噴涂在玻璃纖維膜上，37℃干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 NC膜檢測(cè)層的制備

用pH值7.4的0.01 mol/l PBS分別將羊抗兔IgG的濃度稀釋為1、2 mg/ml，將細(xì)菌抗體分別稀釋為3、2.5、2、1.5、1、0.5 mg/ml。然后設(shè)置膠體金三維噴點(diǎn)平臺(tái)參數(shù)，在NC膜上分別噴涂1、2 mg/ml的羊抗兔IgG作為質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)），在此基礎(chǔ)上分別噴涂6個(gè)不同濃度的抗海豚鏈球菌抗體（柱狀黃桿菌多克隆抗體或嗜水氣單胞菌抗體）作為檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)），形成12個(gè)不同的組合。將包被有抗體的NC膜室溫干燥后完全浸潤(rùn)到1% BSA（由0.01 mol/ml PBS配制）中封閉1 h，取出洗滌3次，干燥后，組裝成試紙條。以純培養(yǎng)的海豚鏈球菌菌液（柱狀黃桿菌或嗜水氣單胞菌）測(cè)試，觀察質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)的顯色情況，確定質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)處包被抗體的最適濃度。

2.5試紙條的組裝

將已包被抗體的NC膜檢測(cè)層依次與吸水紙、膠體金墊、玻璃纖維固定于不干膠底板上組裝，用裁條機(jī)將其裁切成4 mm寬的試紙條，切好的試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋中密封保存于4℃。

2.6 3種試紙條靈敏度的測(cè)定

分別調(diào)整純培養(yǎng)的3種細(xì)菌菌液濃度為3×108~ 3×102cfu/ml，PBS作為陰性對(duì)照，取相應(yīng)的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，觀察顯色結(jié)果；再將檢測(cè)后的試紙條的NC膜檢測(cè)層剪下，用0.05 mol/l的檸檬酸鹽緩沖液(pH值3.8)洗滌平衡5 min后，放入銀染液中，避光20 min，觀察銀染結(jié)果，以肉眼能夠觀察到的檢測(cè)線(xiàn)出現(xiàn)條帶的最低可測(cè)試量作為試紙條的靈敏度。

2.7 3種試紙條特異性的測(cè)定

取1.2節(jié)中所提到的細(xì)菌均調(diào)整細(xì)菌菌液濃度至3×108cfu/ml，以PBS作為陰性對(duì)照，測(cè)試3種試紙條的特異性。

2.8三聯(lián)體卡條的組裝及應(yīng)用

將制作好的3種檢測(cè)試紙裁成6 mm×3 mm的大小封入三聯(lián)卡槽中，即成魚(yú)類(lèi)病原菌三聯(lián)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)試紙。使用時(shí)取待檢病魚(yú)病灶處組織(體表潰爛處、肝、腎、腹水等，5 mg)加0.5 ml PBS研磨，靜置取上清液作為待檢液，分別取0.1 ml待檢液加入魚(yú)類(lèi)病原菌三聯(lián)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)試紙的三個(gè)加樣孔中，靜置，10 min內(nèi)觀察結(jié)果。若某一結(jié)果觀察窗的T線(xiàn)和C線(xiàn)均出現(xiàn)紅線(xiàn)，顯示對(duì)應(yīng)的菌的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；僅C線(xiàn)出現(xiàn)紅線(xiàn)顯示結(jié)果為陰性；僅T線(xiàn)出現(xiàn)紅線(xiàn)而C線(xiàn)未出現(xiàn)紅線(xiàn)或者二者均不出現(xiàn)紅線(xiàn)顯示試紙條無(wú)效。若2個(gè)及以上的細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，顯示結(jié)果為多種菌的混合感染。

三聯(lián)體卡條檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證：嗜水氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果采用RS培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶（AHP）基因[10]、結(jié)合病魚(yú)癥狀進(jìn)行驗(yàn)證；海豚鏈球菌的檢測(cè)結(jié)果采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增該菌16S rRNA的保守區(qū)域[11]、結(jié)合病魚(yú)癥狀進(jìn)行驗(yàn)證；柱狀黃桿菌的檢測(cè)結(jié)果采取選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離（含1% Tobramycin的shieh培養(yǎng)基分離）結(jié)合病魚(yú)癥狀、顯微鏡鏡檢進(jìn)行驗(yàn)證。

3　結(jié)果

3.1金標(biāo)抗體的最適標(biāo)記條件

3.1.1最佳標(biāo)記

pH值以抗海豚鏈球菌抗體的膠體金標(biāo)記結(jié)果為例（見(jiàn)圖1）。加入等量的抗體，1號(hào)管內(nèi)的顏色變藍(lán)，2~5號(hào)管的pH值保持均一紅色。因此，選擇海豚鏈球菌金標(biāo)抗體的最適標(biāo)記pH值為7.0。同樣方法得出，嗜水氣單胞菌金標(biāo)抗體的最適標(biāo)記pH值為7.0，柱狀黃桿菌金標(biāo)抗體的最適標(biāo)記pH值為8.0（見(jiàn)表1）。

圖1海豚鏈球菌金標(biāo)抗體標(biāo)記最適pH值

3.1.2最佳標(biāo)記蛋白量

調(diào)整膠體金的pH值為7.0，加入不等量的抗體(結(jié)果見(jiàn)圖2)。1號(hào)和2號(hào)管均變藍(lán)，說(shuō)明蛋白的加入量過(guò)少；3~6管內(nèi)的顏色保持不變，選擇顏色保持不變的抗體標(biāo)記量為最佳標(biāo)記量，工作濃度選擇比最佳標(biāo)記濃度高一個(gè)級(jí)別的濃度點(diǎn)，因此選擇10 μg/ml作為海豚鏈球菌金標(biāo)抗體的最佳標(biāo)記量。同樣方法得出，嗜水氣單胞菌金標(biāo)抗體的最佳標(biāo)記量為15 μg/ml，柱狀黃桿菌金標(biāo)抗體的最佳標(biāo)記量為15 μg/ml(見(jiàn)表1)。

圖2海豚鏈球菌金標(biāo)抗體最佳抗體標(biāo)記量

3.2檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)最適包被濃度

NC膜檢測(cè)層上檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)處抗體的包被濃度直接影響檢測(cè)結(jié)果。以海豚鏈球菌免疫層析試紙條為例，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在NC膜檢測(cè)層的檢測(cè)線(xiàn)處包被濃度為1.5 mg/ml或2 mg/ml的抗海豚鏈球菌抗體，檢測(cè)線(xiàn)顯色結(jié)果較好，低于1.5 mg/ml檢測(cè)線(xiàn)顯色變淺，質(zhì)控線(xiàn)濃度為1 mg/ml或2 mg/ml顯色效果無(wú)明顯變化(見(jiàn)表2)。因此，最終選擇檢測(cè)線(xiàn)上包被1.5 mg/ml的抗海豚鏈球菌抗體，質(zhì)控線(xiàn)上包被1 mg/ml的羊抗兔IgG。同樣方法測(cè)得嗜水氣單胞菌和柱狀黃桿菌試紙條檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)處所包被的相應(yīng)抗體的最適包被濃度(見(jiàn)表3)。

表1膠體金標(biāo)記的最適條件

表2檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)最適包被濃度

表3檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)最適包被濃度(mg/ml)

3.3 3種試紙條的靈敏度分析

以最適標(biāo)記條件制作金標(biāo)抗體及膠體金墊，以最適濃度抗體包被制作NC膜檢測(cè)層，組裝成試紙條，采用10倍比稀釋的對(duì)應(yīng)菌液測(cè)試所制作試紙條的靈敏度，以試紙條所能檢測(cè)菌液的最低限度作為該試紙條的靈敏度，結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌試紙條的檢測(cè)靈敏度均為3×105cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測(cè)信號(hào)后靈敏度為3×104cfu/ml；柱狀黃桿菌的靈敏度稍低，為3×106cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測(cè)信號(hào)后靈敏度為3×105cfu/ml。

3.4 3種試紙條的特異性分析

以1.2中所列細(xì)菌檢測(cè)3種試紙條的特異性，結(jié)果顯示柱狀黃桿菌試紙條僅對(duì)柱狀黃桿菌菌液的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)另外12種菌液的檢測(cè)結(jié)果為陰性；嗜水氣單胞菌試紙條僅對(duì)嗜水氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)另外12種菌液的檢測(cè)結(jié)果為陰性；海豚鏈球菌試紙條僅對(duì)海豚鏈球菌的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)另外12種菌液的檢測(cè)結(jié)果為陰性；所制備的3種試紙條具有良好的特異性。

3.5三聯(lián)體卡條的應(yīng)用

挑選瀕死且癥狀明顯的魚(yú)進(jìn)行疾病診察，疑為細(xì)菌病的病魚(yú)，取肝臟、脾臟、腹水、腎臟組織或其它病變部位，研磨后取上清采用三聯(lián)體卡條進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)共收集疑為細(xì)菌病的病魚(yú)122例，其中檢出嗜水氣單胞菌陽(yáng)性樣品41個(gè)，實(shí)驗(yàn)室確診陽(yáng)性樣品50個(gè)，符合率為92.6%，海豚鏈球菌陽(yáng)性樣品20個(gè)，實(shí)驗(yàn)室確診陽(yáng)性樣品32個(gè)，符合率為90.2%，柱狀黃桿菌陽(yáng)性樣品16個(gè)，實(shí)驗(yàn)室確診陽(yáng)性樣品31個(gè)，符合率為87.7%。以上結(jié)果證實(shí)，制備的試紙條具有較高的準(zhǔn)確性。部分檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

4　討論

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的各種暴發(fā)性病害時(shí)有發(fā)生，危害也日益嚴(yán)重，每年由病害所致的直接經(jīng)濟(jì)損失至少為數(shù)百億元以上。細(xì)菌性疾病是其中危害最為廣泛的一類(lèi)疾病，病原種類(lèi)繁多，傳播擴(kuò)散快，發(fā)病情況復(fù)雜，多為多種病原混合感染，病原菌環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，對(duì)抗菌素易產(chǎn)生耐藥性，病害一旦發(fā)生，很難控制?，F(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)試劑盒產(chǎn)品多針對(duì)于一種病原進(jìn)行檢測(cè)，效率較低，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可系統(tǒng)全面反映疾病發(fā)生的整體狀況，但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。李永芹[12]制備了6種病原菌的檢測(cè)芯片，可用于海豚鏈球菌、鰻利斯頓氏菌、熒光假單胞菌、海分枝桿菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、殺鮭氣單胞菌的現(xiàn)場(chǎng)平行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程仍需3 h以上。本研究分別制作了3種常見(jiàn)水產(chǎn)病原菌的試紙條，并將其組裝成三聯(lián)體卡條，僅需5~10 min便可同時(shí)檢測(cè)3種病原菌，應(yīng)用起來(lái)更加方便，尤其適用于基層推廣及大量樣本的快速篩查，為養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)疾病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷提供技術(shù)支持。

注：①1、2、3分別為柱狀黃桿菌試紙條、海豚鏈球菌試紙條、嗜水氣單胞菌試紙條；②a為待檢樣品中含海豚鏈球菌，b為待檢樣品中含柱狀黃桿菌，c為待檢樣品中同時(shí)含海豚鏈球菌和柱狀黃桿菌。圖3部分樣品檢測(cè)結(jié)果

本研究所制備的3種魚(yú)類(lèi)病原菌三聯(lián)體卡條，對(duì)海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌的檢測(cè)靈敏度均為3× 105cfu/ml，經(jīng)銀染放大檢測(cè)信號(hào)后，檢測(cè)靈敏度可達(dá)3×104cfu/ml，對(duì)柱狀黃桿菌的檢測(cè)靈敏度為3× 106cfu/ml，銀染后可達(dá)3×105cfu/ml，與已報(bào)道的溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)試紙條的靈敏度相當(dāng)，均在105~106cfu/ml。生產(chǎn)上一般認(rèn)為，病原菌數(shù)量超過(guò)104cfu/ml可能導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)發(fā)病。但水產(chǎn)病原菌多為條件致病菌，病原菌數(shù)量并非致病的決定性因素，病害發(fā)生是宿主、病原、環(huán)境三方面綜合作用的結(jié)果。因此，本研究所制作的三聯(lián)體卡條檢測(cè)結(jié)果對(duì)生產(chǎn)上疾病的預(yù)防仍具有一定的參考意義。

在細(xì)菌檢測(cè)應(yīng)用中，采用全菌抗原制備的單克隆抗體容易出現(xiàn)漏檢情況，尤其是對(duì)于抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，單克隆抗體并不占優(yōu)勢(shì)，并且單克隆抗體制備技術(shù)要求較高，制備周期長(zhǎng)從而會(huì)增加試紙條的研發(fā)成本。本次所制作的試紙條采用的均為細(xì)菌全菌免疫制作的多抗，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所制作的試紙條具有較好的特異性和靈敏度，在實(shí)際應(yīng)用中檢測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相比，符合率在87.7%以上，在一定程度上證明了采用多克隆抗體制備試紙條的可行性。

參考文獻(xiàn)

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（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）

Development and application of triplet-immunochromatographic strip for simultaneous detection of three aquatic pathogens

Liu Yijuan, Sun Jinsheng, Bao Haiyan, Zhang Qin, Zang Li, Xu Xiaoli

Abstract：Immunochromatographic strips for detection of Streptococcus iniae, Flavobacterium colum?nareand Aeromonashydrophilawere developmented respectively and integrated as triplet-immunochro?matographic strip. The triplet-immunochromatographic strip was applied in simultaneous detection of three aquatic pathogens. Results showed that the triplet-immunochromatographic strip had no cross-re?action with other 12 kinds of aquatic pathogens and the sensitivities were both 3×105cfu/ml to S.iniae, A.hydrophila, 3×106cfu/ml to F.columnare. This method was applied in samples of diseased fish and concordance of the triplet-immunochromatographic strip with methods for detection of pathogens in the lab were above 87.7%. The operation was rapid, simple and 3 kinds of pathogens can be detected in 5~ 10 min simultaneously and the detection efficiency was improved. The triplet-immunochromatographic strip could be used in aquaculture on-spot and rapid screening of a large number of samples.

Key words：Flavobacteriumcolumnare；Aeromonas hydrophila；Streptococcus iniae；immunochromato?graphic strip；triplet-immunochromatographic strip

基金項(xiàng)目：天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目[12ZCZDNC00900]

收稿日期：2015-10-03

通訊作者：徐曉麗，博士。

作者簡(jiǎn)介：劉亦娟，碩士，研究方向?yàn)轸~(yú)類(lèi)病害防治。

中圖分類(lèi)號(hào)：S941

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）04-0056-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.014