馮素萍，劉　超，徐楨貞（海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞572200）

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基于EST的茶樹分子生物學(xué)研究

馮素萍，劉超，徐楨貞
（海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞572200）

摘要：本文通過(guò)對(duì)茶樹40對(duì)引物的EST序列設(shè)計(jì)，研究茶樹分子生物學(xué)EST-SSR引物的開(kāi)發(fā)與通用性，并挑選其中多態(tài)性和穩(wěn)定性較好的13對(duì)引物，經(jīng)研究分析得到其重復(fù)基序多超過(guò)18bp，且通用率高達(dá)46%以上，從而充分驗(yàn)證茶樹分子EST序列引物的通用性特征。那么，下面將重點(diǎn)研究基于EST的茶樹分子生物學(xué)特征。

關(guān)鍵詞：茶樹；EST；茶樹分子；生物學(xué)

對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行PCR試驗(yàn)，由聚丙烯胺凝膠電泳加以驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)出聚丙烯胺凝膠電泳的條帶數(shù)目并分類與分析，然后按照EST-SSR多態(tài)性利用軟件來(lái)分析聚類，建構(gòu)相應(yīng)的系統(tǒng)樹，以此辨識(shí)不同茶樹的親疏關(guān)系，歸納茶樹分類法。分析茶樹遺傳構(gòu)造，討論茶樹的生物學(xué)性狀存在差異性的遺傳學(xué)原理，并驗(yàn)證EST序列和設(shè)計(jì)SSR引物的可行性與實(shí)際作用，最終試驗(yàn)驗(yàn)證EST-SSR在生物種之間通用性的優(yōu)劣程度。

1 達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序EST-SSR

上世紀(jì)八十年代末，由美國(guó)著名科學(xué)家Venter首次提出基因組EST計(jì)劃，且人類基因組試驗(yàn)逐步被應(yīng)用于植物類試驗(yàn)，它可利用cDNA實(shí)現(xiàn)隨機(jī)測(cè)序工作，以此認(rèn)識(shí)基因組試驗(yàn)。EST-SSR具有SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，且兼具通用特性好、引物成本低、思路縝密和統(tǒng)計(jì)方便等好處。因EST-SSR源自與目標(biāo)性狀具有直接聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄區(qū)，因而利用標(biāo)記分子的方法來(lái)幫助篩選育種在應(yīng)用方面相較于全基因組SSR要優(yōu)越的多。種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用EST-SSR方法會(huì)體現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄區(qū)的各異性，即反映出植物性狀遺傳的多樣性特征。EST-SSR被定位于性狀基因內(nèi)部，可直接選擇控制目標(biāo)性狀的等位基因。另外，分子標(biāo)記也可用于MAS的篩選，不同植物的EST-SSR仍然存在較高的共線特征，因而可以說(shuō)明該方法在作圖研究與合并遺傳圖譜錨定位點(diǎn)中適用。

SSR具有生物通用性特征。由Marion S.Roder提出基于傳統(tǒng)基因組的SSR引物的通用性特征在不同物種間表現(xiàn)極差，EST-SSR引物則通過(guò)較為保守的側(cè)翼序列與穩(wěn)定的SSR進(jìn)化其通用性特征在不同物種間表現(xiàn)尚好。不同物種之間EST-SSR引物的生物通用性可保障分子標(biāo)記的價(jià)值和標(biāo)記數(shù)量，這一點(diǎn)在SSR引物中就無(wú)法得以保障。究其原因，EST-SSR的側(cè)翼序列在不同物種間保守關(guān)系牢靠，因而使其引物可以在不同物種之間保持良好的生物通用性。

近年，有關(guān)EST研究技術(shù)水平不斷提高，龐大的EST數(shù)據(jù)儼然是SSR的主要來(lái)源。據(jù)可靠數(shù)據(jù)分析，1%～5%的植物在EST中含可標(biāo)記的SSR。由林范學(xué)按照FGP與NCBI檢索EST序列，然后經(jīng)軟件處理設(shè)計(jì)EST-SSR引物，最終衍生出多態(tài)性的條帶。

2 茶樹分子EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及生物學(xué)研究

討論植物物種種質(zhì)的資源分類，茶樹的生理分化類別一直在完善中，而分子標(biāo)記技術(shù)水平也在不斷提高。然而，茶樹SSR研究對(duì)比其他物種分子標(biāo)記要相對(duì)滯后，可用引物畢竟很少，由此也導(dǎo)致有關(guān)茶樹采取SSR標(biāo)記分子的報(bào)道少之又少，成為當(dāng)下阻礙SSR技術(shù)發(fā)展的重要原因。另外一方面講，建構(gòu)茶樹基因庫(kù)與遺傳圖譜系統(tǒng)不足也對(duì)SSR引物的設(shè)計(jì)造成了極大的影響。近年來(lái)，龐大的EST數(shù)據(jù)群作為SSR引物設(shè)計(jì)的直接來(lái)源，逐步發(fā)展起來(lái)的EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)其實(shí)是一種建立在表達(dá)序列之上研發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)。相較于普通SSR技術(shù)，EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)主要依仗的是保守的側(cè)翼序列和穩(wěn)定的進(jìn)化過(guò)程，由此即可保障EST-SSR引物能夠在不同物種之間保有良好的通用性特征。另外，EST-SSR引物還具有在物種間靈活轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，其高通用性特征也能保證分子標(biāo)記的高價(jià)值和良好的標(biāo)記數(shù)量，這一點(diǎn)在SSR方面就顯得比較差。忻雅等人將EST-SSR引物與其近親物種完成擴(kuò)增，其擴(kuò)增效果基本不低于50%，更有甚者可達(dá)到超過(guò)80%的擴(kuò)增效果，如此之高的擴(kuò)增下過(guò)間接說(shuō)明EST-SSR分子標(biāo)記于近親物種之間的高通用性。ESTSSR引物與普通SSR引物通用性特征的研究報(bào)道更多集中于如玉米、蠶豆、水稻、黃豆和馬尾松等經(jīng)濟(jì)作物。從研究結(jié)果來(lái)看，ESTSSR引物的通用性顯然要高于普通SSR引物。當(dāng)前，EST-SSR分子標(biāo)記不僅限于對(duì)物種遺傳多樣性的研究，更為實(shí)際的應(yīng)用則是物種種質(zhì)鑒定與選育。在建構(gòu)物種遺傳圖譜系統(tǒng)當(dāng)中，EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)得到了良好的發(fā)展機(jī)會(huì)。本文試驗(yàn)將研究EST-SSR分子標(biāo)記在茶樹中的應(yīng)用，討論分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)發(fā)和物種通用性問(wèn)題，以期研發(fā)出一種既具有精準(zhǔn)性又具便捷性的遺傳分類引物，以此即可嚴(yán)重不同物種之間EST-SSR引物的高通用性特征。

本節(jié)內(nèi)容以江西地區(qū)野外采集可供試驗(yàn)研究的17類茶樹樣本，然后統(tǒng)一采取EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)探討茶樹物種的通用性特征。按照EST-SSR引物能在物種間通用的基本特征，并從NCBI與EMBL檢索有關(guān)茶樹的EST序列，同時(shí)輔以EST-trimmer、CAP3和SSRIT等程序予以處理，PCR引物則是利用PRIMER5.0程序來(lái)設(shè)計(jì)的。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，茶樹的EST序列并不適合于SSR引物，按照此法我們也可選擇親近的茶樹EST-SSR引物。

定位查找genebank內(nèi)的茶樹EST序列，我們可以查找到20條符合要求的茶樹EST序列，然后采用SSRhunter程序予以分析與處理，并未找到符合SSR引物設(shè)計(jì)要求的茶樹EST序列，因而利用茶樹EST序列來(lái)設(shè)計(jì)SSR引物可實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證其通用性的目的。劉春燕、王艷芳等人按照已公布于世NCBI的茶樹EST序列信息，利用EST-trimmer程序?qū)ζ溆枰院Y選，并采取CP3程序?qū)π蛄衅斡枰苑治雠c聚類，得到品質(zhì)較高的Unigene，然后利用MISA程序再行處理得到40對(duì)EST引物。借助此40對(duì)EST引物作試驗(yàn)分析，并以重復(fù)基序在茶樹出現(xiàn)的頻率、GC含量約為50%左右、退火溫度約58℃左右、序列片段長(zhǎng)約200bp左右和EST引物長(zhǎng)約20bp作為基本標(biāo)準(zhǔn)，篩選出28對(duì)執(zhí)行下一步試驗(yàn)有價(jià)值的EST引物。

對(duì)以上篩選出的28對(duì)EST引物，記錄其分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增效果，按照不同的擴(kuò)增率依上而下分別將其賦值記為“0”，有條帶的則將賦值記為“1”。統(tǒng)一構(gòu)建EST-SSR引物的“0-1”數(shù)據(jù)表，以矩陣形式轉(zhuǎn)化不同分析程序相應(yīng)數(shù)據(jù)格式并予以嚴(yán)格分析。然后，利用POPGENE32、POWERMARKER V3.25對(duì)等位基因數(shù)（A）、有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因頻率（P）、平均基因多態(tài)性和多態(tài)信息含量（PIC）等物種遺傳多樣性參數(shù)和物種遺傳距離指標(biāo)予以運(yùn)算，得出計(jì)算結(jié)果。

3 EST-SSR茶樹分子標(biāo)記試驗(yàn)的結(jié)果分析

按照Lewers針對(duì)分子生物學(xué)的理論研究成果來(lái)看，EST-SSR引物的設(shè)計(jì)于SSR長(zhǎng)度的要求較高，其長(zhǎng)度于EST-SSR引物在不同物種之間多態(tài)性的效率息息相關(guān)。我們將SSR長(zhǎng)度設(shè)定在18bp左右，目的便是為了增強(qiáng)EST-SSR引物擴(kuò)增的多態(tài)性。因此，從40對(duì)EST-SSR引物中篩選出28對(duì)，均要求其長(zhǎng)度在12bp～22bp范圍以內(nèi)。其中，13對(duì)具有二核苷酸重復(fù)基序，經(jīng)電泳鑒定具備多態(tài)性的則為3對(duì)；15對(duì)具有三核苷酸重復(fù)基序，經(jīng)電泳鑒定具備多態(tài)性的則為10對(duì)。這樣的結(jié)果與劉春燕2010年所做試驗(yàn)的結(jié)果基本相同。經(jīng)本次試驗(yàn)證明，28對(duì)EST-SSR引物可擴(kuò)展的多達(dá)24對(duì)，且其中13 對(duì)EST-SSR引物附特異性擴(kuò)增產(chǎn)物并具有良好的多態(tài)性特征。

上述EST-SSR引物附特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其多態(tài)性特征的表現(xiàn)則為茶樹間條帶的差異性，這也說(shuō)明了茶樹之間的物種差異性。大部分EST-SSR引物的重復(fù)基序都大于18bp，總體通用率高達(dá)46.4%，較之黑莓、甜瓜和鯉魚等物種要高的多。另外，對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，共計(jì)得到81條條帶，其擴(kuò)增片段均保持在300bp左右。每對(duì)ESTSSR引物的擴(kuò)增條帶數(shù)目少則2條，多則14條。

本論文基于前人研究成果，精心篩選28對(duì)茶樹的EST-SSR引物，并對(duì)其中17個(gè)茶樹全基因組DNA加以擴(kuò)增與鑒定，并成功擴(kuò)增其中24對(duì)EST-SSR引物，占據(jù)總數(shù)約為85.7%，而成功擴(kuò)增的ESTSSR引物又有13對(duì)可作為有效通用引物，通用率高達(dá)46.4%。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文基于EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究茶樹分子生物學(xué)特征（物種通用性），著眼分子生物學(xué)對(duì)江西地區(qū)茶樹予以種類分析與聚類分析，建構(gòu)系統(tǒng)樹，比較物種親疏關(guān)系，并揭示江西地區(qū)茶樹的物種遺傳性狀的構(gòu)造、進(jìn)化過(guò)程和種質(zhì)資源情況。同時(shí)，改善我國(guó)在茶樹分子標(biāo)記技術(shù)水平不高的現(xiàn)狀，通過(guò)試驗(yàn)研究驗(yàn)證茶樹EST-SSR引物的物種通用性特征，且說(shuō)明EST-SSR技術(shù)比SSR技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，進(jìn)而深入推廣EST-SSR作為一種物種分子標(biāo)記手段應(yīng)該成為物種鑒別的第一選擇。EST序列原因物種基因的表達(dá)過(guò)程，可反映出基因編碼的信息特征和轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異性，因而在茶樹分子遺傳多樣性分析及其建構(gòu)遺傳連鎖圖、分子標(biāo)記、篩選育種等研究皆可適用，以此推廣EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為茶樹分子生物學(xué)研究的基本理論和可靠依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］張亞麗，趙麗萍，馬春雷，等.茶樹親環(huán)素基因cDNA全長(zhǎng)的分析鑒定與原核表達(dá)［J］.茶葉科學(xué)，2011，27（2）：112-114.

［2］阮宏鵬.復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合氨茶堿預(yù)防急性輕癥高原?。跩］.茶葉科學(xué)，2010，12（9）：76-79.

［3］傅海平，張亞蓮，常碩其，等.湖南省茶葉研究所茶園土壤養(yǎng)分現(xiàn)狀及20余年變化研究［D］.2009.

［4］戴前穎，夏濤，朱博，等.β-環(huán)糊精對(duì)茶湯體系的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性影響［J］.茶葉科學(xué)，2012，11（15）：82-84.

［5］朱林，江昌俊，葉愛(ài)華，等.茶樹ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.茶葉科學(xué)，2010，3（22）：59-64.

作者簡(jiǎn)介：馮素萍（1972-），女，河南汝州人，博士，副教授，研究方向：花生生理及分子生物學(xué)研究。