徐文丹，代曉南，朱倩，張蓓，高超，高莉，劉嘉茵，崔毓桂

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LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體的構(gòu)建及其在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

徐文丹，代曉南，朱倩，張蓓，高超，高莉，劉嘉茵，崔毓桂

【摘要】目的：構(gòu)建鈣視網(wǎng)膜蛋白（CALB2）基因超表達(dá)及小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體，觀察CALB2對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成的調(diào)節(jié)作用。方法：合成超表達(dá)及干涉的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）鑒定陽(yáng)性重組子后測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)構(gòu)建成功的超表達(dá)及干涉慢病毒載體。用上述慢病毒載體分別感染MLTC-1及R2C間質(zhì)細(xì)胞，觀察感染效率，而后用放射免疫法檢測(cè)睪酮和孕酮的合成。結(jié)果：PCR和基因測(cè)序證實(shí)LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體構(gòu)建成功，并可高效感染MLTC-1及R2C細(xì)胞。超表達(dá)CALB2后，MLTC-1細(xì)胞睪酮生成顯著增加（P＜0.001）；干涉CALB2表達(dá)后，R2C間質(zhì)細(xì)胞孕酮生成顯著減少（P＜0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建了calb2基因超表達(dá)及干涉慢病毒載體，并可體外轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞系。初步結(jié)果表明，CALB2可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素生成。

【關(guān)鍵詞】鈣結(jié)合蛋白，維生素D依賴性；慢病毒屬；睪丸；萊迪希細(xì)胞；雄激素類

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：96-100）

睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌雄激素主要受下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-gonad axis，HPG軸）調(diào)控，間質(zhì)細(xì)胞膜上的黃體生成激素（LH）受體（LHR）介導(dǎo)垂體分泌的LH作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，雄激素合成還受到睪丸內(nèi)的局部調(diào)節(jié)——即通過(guò)睪丸內(nèi)的旁分泌及自分泌途徑調(diào)節(jié)雄激素的合成[1]，這些旁分泌及自分泌因子主要有胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、脂聯(lián)素異構(gòu)體等[2-4]。間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素的能力在成年期最強(qiáng)，中老年期間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)雄激素合成能力下降，將會(huì)引起男性性欲下降、勃起障礙、骨質(zhì)疏松及生育力下降等癥狀，即男性遲發(fā)型性腺功能減退癥（late onset gonad hypofunction，LOH），影響著中老年男性的生活質(zhì)量[5]。研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素生成調(diào)節(jié)機(jī)制有利于理解LOH的發(fā)病機(jī)制。

鈣視網(wǎng)膜蛋白（Calretinin，CALB2）是鈣結(jié)合蛋白家族成員之一，分子質(zhì)量為29 ku，有6個(gè)EF-手性結(jié)構(gòu)域，4個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)協(xié)同作用對(duì)鈣離子（Ca2+）有高親和力，1個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)a2+有低親和力，另1個(gè)對(duì)Ca2+沒(méi)有親和力[6]，其最早由Rogers在雞的視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)并命名[7]，主要在神經(jīng)組織、卵巢、腎上腺表達(dá)[8-9]，主要功能為緩沖細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+以防Ca2+超載[10]，而Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，可通過(guò)蛋白激酶C （PKC）或鈣調(diào)蛋白激活下游蛋白酶，參與骨骼肌/心肌收縮、神經(jīng)反應(yīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、激素合成與應(yīng)用、內(nèi)分泌和免疫等，在細(xì)胞核內(nèi)對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖、壞死和凋亡等功能也起重要作用[11-14]。研究表明，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素時(shí)，胞內(nèi)Ca2+增多[15]；阻斷Ca2+通道后，雄激素合成減少，可見(jiàn)Ca2+作為第二信使調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成[16]。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，CALB2在大鼠和人類睪丸間質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)，且在成年期表達(dá)最高[17-18]，這提示CALB2參與調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成。為了進(jìn)一步研究CALB2在生殖系統(tǒng)中的作用，本研究構(gòu)建了calb2超表達(dá)和干涉的慢病毒載體，并在大鼠、小鼠間質(zhì)細(xì)胞系表達(dá)，觀察其對(duì)雄激素合成的影響。

1　對(duì)象與方法

1.1研究試劑MLTC-1和R2C細(xì)胞系（美國(guó)ATCC公司），F(xiàn)12（1×）培養(yǎng)基、胎牛、馬血清（美國(guó)Gibco公司），DMEM高糖和RMPA1640（美國(guó)Hyclon公司），慢病毒載體系統(tǒng)質(zhì)粒GV287（美國(guó)Stratagene公司），293T、大腸桿菌DH5α細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科提供，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、限制性內(nèi)切酶（BamHI/AgeI）、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶（美國(guó)NEB公司），質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），Trizol（美國(guó)Gibco公司），放射免疫試劑盒（北方科技有限公司），二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、胰酶、細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白抑制劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗鼠一抗CALB2抗體（美國(guó)Santa Cruse公司），鼠抗鼠一抗ACTIN（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔/抗鼠二抗（美國(guó)Jackson immunoresearch公司），發(fā)光試劑ECL（日本TAKARA公司）。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用了2種睪丸間質(zhì)細(xì)胞系：小鼠MLTC-1細(xì)胞和大鼠R2C細(xì)胞，前者細(xì)胞膜上有人絨毛膜促性腺激素（hCG）受體，細(xì)胞內(nèi)含有全套的睪酮合成酶，可以完成睪酮合成的全過(guò)程；后者可合成大量孕酮，甚至不經(jīng)由hCG刺激，但是因?yàn)樵摷?xì)胞系缺乏17α-羥化酶和17，20-裂解酶，因而不能最終合成睪酮[19]。后期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MLTC-1細(xì)胞本身低水平表達(dá)CALB2，適用于超表達(dá)CALB2，用以觀察CALB2超表達(dá)后睪酮合成的變化；大鼠R2C細(xì)胞本身高水平表達(dá)CALB2，適宜干涉其CALB2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，用于觀察CALB2干

涉后孕酮合成的變化。小鼠MLTC-1細(xì)胞用10%胎牛血清+ 90%的RMPA 1640的培養(yǎng)液培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，為防止細(xì)菌污染添加了10%青霉素和鏈霉素；大鼠R2C細(xì)胞培養(yǎng)液由15%馬血清+2.5%胎牛血清+82.5 %F12（1×）組成，未添加青霉素和鏈霉素；293T細(xì)胞的培養(yǎng)液用10%胎牛血清+90%DMEM高糖培養(yǎng)，均放置于37℃，5% CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2 calb2超表達(dá)及干涉質(zhì)粒構(gòu)建及基因測(cè)序驗(yàn)證超表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建——設(shè)計(jì)5′端為BamHI酶切位點(diǎn)，3′端為AgeI酶切位點(diǎn)的編碼calb2上下游引物（下劃線為酶切位點(diǎn)）:上游引物：5′-TAGAGGATCCCGCCACCATGGCTG-3′，下游引物：3′-CAGTGAGCCCCCCATGACCGGTAT-5′，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）獲取。合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，后冷卻至室溫，通過(guò)T4 DNA連接酶將雙酶切線性化的載體和DNA片段在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行連接反應(yīng)，并于16℃連接過(guò)夜，然后連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性克隆用于基因測(cè)序。calb2干涉質(zhì)粒構(gòu)建——首先合成含干擾序列的單鏈DNA oligo（5′-CCGGCAGGAAGAGCGTCATGTC CTTCTCGAGAAGGACATGACGCTCTTCCTGTTTTTG-3′和5′-AATTCAAAAACAGGAAGAGCGTCATGTCCTTCTCGAGAAGG ACATGACGCTCTTCCTG-3′），然后退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈，再通過(guò)其兩端所含酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的RNA干擾（RNAi）慢病毒載體上，后續(xù)步驟與超表達(dá)相似。

1.2.3慢病毒包裝與滴度測(cè)定首先制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，將3種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000的使用說(shuō)明進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)基，后培養(yǎng)48 h，收集含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮得到高滴度的慢病毒濃縮液，最后在293T細(xì)胞中測(cè)定和標(biāo)定病毒滴度。

1.2.4重組超表達(dá)及干涉CALB2慢病毒載體感染間質(zhì)細(xì)胞按感染復(fù)數(shù)（MOI）值為100感染MLTC-1及R2C細(xì)胞。培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞于12孔板，至細(xì)胞長(zhǎng)至30%開(kāi)始慢病毒轉(zhuǎn)染，聚凝胺（polybrene）終濃度為5 μL/mL，分為2組：對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中加空載慢病毒，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加超表達(dá)LV-calb2慢病毒載體，感染96 h后熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光感染率，收集細(xì)胞，留作蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）；收集培養(yǎng)液，留測(cè)睪酮濃度。R2C細(xì)胞處理除添加病毒為L(zhǎng)V-siRNA-calb2和收集培養(yǎng)液，留測(cè)孕酮濃度外，其余與MLTC-1組處理相同。

1.2.5 Western blotting提取細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)染96 h后成功的細(xì)胞使用胰酶消化后用等量培養(yǎng)液中和胰酶，離心去上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍后加入裂解液，混勻后放于搖床30 min，再以12 000 r/min離心20 min取上清即得到細(xì)胞蛋白，保存于-80℃。BCA測(cè)定蛋白濃度：以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，酶標(biāo)儀以562 nm測(cè)定吸光度值測(cè)定蛋白濃度后配樣（50 μg）。Western blotting：配12%分離膠[3.8 mL ddH2O、4 mL 30%AA、2.6 mL HCl（pH 8.8）、100 μL 10%SDS、100 μL 10%

APS]80 V預(yù)電泳10 min后轉(zhuǎn)為100 V電泳90 min，每孔上樣50 μg。隨后轉(zhuǎn)膜250 mA 120 min。5%牛奶封閉1 h后4℃過(guò)夜孵育一抗CALB2（1∶1 000）及內(nèi)參ACTIN（1∶10 000），第2天洗膜10 min共3次，孵育二抗（1∶1 000）1 h后洗膜，而后ECL顯影液檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并分析蛋白條帶灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6放射免疫法測(cè)定培養(yǎng)液睪酮及孕酮濃度慢病毒轉(zhuǎn)染成功后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，于-80℃保存，留作測(cè)定睪酮或孕酮。按照試劑說(shuō)明書(shū)，采用放射免疫法分別測(cè)定睪酮和孕酮濃度，測(cè)定敏感度分別為＜0.02 ng/mL和＜0.2 ng/mL；睪酮和孕酮濃度測(cè)定的精密度：批內(nèi)CV均＜10%，批間CV均＜15%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒載體基因測(cè)序經(jīng)基因測(cè)序鑒定，LV-calb2和LV-siRNA-calb2的目的序列與設(shè)計(jì)序列相符，LV-calb2和LV-siRNA-calb2載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1（見(jiàn)后插一）。

2.2慢病毒滴度測(cè)定經(jīng)梯度稀釋法測(cè)定超表達(dá)LV-calb2滴度為2×108TU/mL，干涉LV-siRNA-calb2滴度為4×108TU/mL。

2.3慢病毒感染細(xì)胞效率LV-calb2慢病毒感染MLTC-1細(xì)胞96 h后，較對(duì)照組CALB2表達(dá)上調(diào)3倍以上（P＜0.001），對(duì)照組MLTC-1細(xì)胞基本不表達(dá)CALB2。LV-siRNA-calb2感染R2C細(xì)胞96 h后，較對(duì)照組CALB2表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2（見(jiàn)后插一）。2.4慢病毒載體感染間質(zhì)細(xì)胞后激素生成MLTC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-calb296h后，培養(yǎng)液中睪酮水平顯著升高（P＜0.001）。而R2C細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-siRNA-calb2 96 h后，孕酮生成顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

3　討論

本研究使用的慢病毒載體是以人免疫缺陷病毒（HIV）為基礎(chǔ)構(gòu)建的基因治療載體，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，幾乎可用于所有的細(xì)胞包括原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較高[20]。慢病毒攜帶的基因?yàn)镽NA，可整合至宿主細(xì)胞，并可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期表達(dá)，安全性高，而免疫反應(yīng)小[20]。與腺病毒載體相同，慢病毒載體也可以帶有綠色熒光標(biāo)記，用于觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率[20]。但腺病毒載體只能瞬時(shí)表達(dá)目的蛋白，不能穩(wěn)定表達(dá)，且細(xì)胞毒性大[21-22]。本課題組曾構(gòu)建calb2超表達(dá)及干涉腺病毒載體[23-24]，其中MLTC-1細(xì)胞可高效轉(zhuǎn)染，但R2C不能被轉(zhuǎn)染，隨后嘗試過(guò)電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體等方法均未成功。因而，本課題組參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[25-26]成功構(gòu)建了慢病毒載體LV-calb2和LV-siRNA-calb2，并經(jīng)鑒定和細(xì)胞轉(zhuǎn)染測(cè)試LV-calb2和LV-siRNA-calb2感染的MLTC-1和R2C細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能夠成功轉(zhuǎn)染這2種睪丸間質(zhì)細(xì)胞。

圖3 MLTC-1和R2C分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2后激素生成的水平

CALB2屬于鈣結(jié)合蛋白家族，與成員鈣調(diào)蛋白和小清蛋白相似，是細(xì)胞內(nèi)Ca2+緩沖劑[27]，還可以作為Ca2+感受器發(fā)揮作用，與Ca2+通道互相作用[28]，促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。CALB2在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而控制神經(jīng)元的可塑性[29]；還可以與亨廷頓蛋白相互作用，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。近年發(fā)現(xiàn)，在卵巢和睪丸中也存在CALB2的表達(dá)，且成年期睪丸中的表達(dá)水平最高；睪丸中CALB2表達(dá)定位于間質(zhì)細(xì)胞，因此其參與了間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素這一主要功能[31]。間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，這一功能主要受HPG軸調(diào)節(jié)[32]，垂體分泌的LH促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞合成并分泌睪酮[33]。LH結(jié)合間質(zhì)細(xì)胞膜LHR，激活腺苷酸環(huán)化酶，將三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP）進(jìn)而激活蛋白激酶A（PKA），PKA可激活下游的類固醇激素合成酶的轉(zhuǎn)錄因子或直接激活類固醇激素合成酶，促進(jìn)睪酮合成[34]。除上述經(jīng)典的LH-PKA通路外，LH也可激活磷脂酶C （PLC）將磷酸肌醇裂解為三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油，IP3可激活胞內(nèi)鈣通道，從而胞質(zhì)Ca2+增多，激活下游PKC或鈣調(diào)蛋白通路，發(fā)揮和PKA類似作用?？梢?jiàn)Ca2+也作為L(zhǎng)H下游的第二信使，調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成[35]，其作用機(jī)制可能通過(guò)Ca2+激活鈣調(diào)蛋白進(jìn)而促進(jìn)類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）表達(dá)增加雄激素的合成[36]。CALB2可表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中并作為Ca2+緩沖劑，可能作為一自分泌因子調(diào)控睪酮的生成[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠間質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CALB2可促進(jìn)雄激素的合成；大鼠間質(zhì)細(xì)胞降低CALB2表達(dá)則抑制雄激素前體（孕酮）的合成，綜上，推測(cè)CALB2可能通過(guò)作用于Ca2+進(jìn)而正向調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的合成。

本研究成功構(gòu)建慢病毒載體LV-calb2和LV-siRNA-calb2，可高效感染睪丸間質(zhì)細(xì)胞，并且也證實(shí)了CALB2促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素生成，為下一步研究CALB2在間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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[本文編輯王昕]

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·論著·

Construction of LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 and Expression in Leydig Cells of Teste

XU Wen-dan，DAI Xiao -nan，ZHU Qian，ZHANG Bei，GAO Chao，GAO Li，LIU Jia -yin，CUI Yu -gui. Clinical Center of Reproductive Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029,China

【Abstract】Objective：To explore the effect of CALB2 on steriodogenesis in testicular Leydig cell，we firstly established LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors. Methods：Firstly，the over-expression and interference plasmids were synthysized，and the bacterial competent cells were prepared ahead. Secondly，polymerase chain reaction（PCR）and gene sequencing were administered to ensure the LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors constructed successfully. At last，the infection efficiency was tested and then the level of testosterone in MLTC-1 and the level of progesterone in R2C were measured by radioimmunaossay after MLTC-1 and R2C were infected with LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 respectively. Results：PCR and gene sequencing confirmed that LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors were established，with the capacity to infect efficiently MLTC -1 and R2C. Testosterone production was significantly increased in the MLTC -1 infected with LV-calb2（P＜0.001）, while progesterone production was significantly decreased in R2C infected with LV-siRNA-calb2（P＜0.05）. Conclusions：This study successfully constructed LV-calb2 and LV-siRNA-calb2 lentivirus vectors which could infect Leydig cells with high-efficiency. The preliminary result indicated that CALB2 promoted steriodogenesis in Leydig cells.

【Keywords】Calcium-binding protein, vitamin D-dependent；Lentivirus；Testis；Leydig cells；Androgens

收稿日期：（2015-11-20）

Corresponding author：CUI Yu-gui，cuiygnj@njmu.edu.cn

通信作者：崔毓桂，E-mail：cuiygnj@njmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81170559，81370754，31301182）；江蘇省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（ZX201110）；江蘇省婦幼保健重點(diǎn)學(xué)科（FXK201221）

作者單位：210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科