王慶華，王生存，李　斌，劉　春，吳劉成，王　旭，彭曉清 ，邵義祥*

(1.南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

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蛋白磷酸酶2A的Cβ亞基在胚胎成纖維細胞凋亡過程中的作用

王慶華1，王生存1，李斌2，劉春1，吳劉成1，王旭1，彭曉清1，邵義祥1*

(1.南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

摘要：為探究蛋白磷酸酶2A的Cβ亞基在胚胎成纖維細胞(MEFs)凋亡過程中的作用，用Cβ+/-的雜合子雄鼠與雌鼠1∶2配對，取胚胎期12.5 d(E12.5)的胚胎制備MEFs，用PCR、RT-PCR和Western blot方法進行基因型鑒定。同時對P3代MEFs利用流式分選技術檢測其細胞凋亡和細胞周期的變化，并采用Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。結果采用胰酶消化方法成功獲得了MEFs，DNA、RNA和蛋白水平鑒定顯示獲得了3對3的野生型和Cβ基因敲除MEFs。流式分選發(fā)現(xiàn)Cβ基因敲除MEFs和野生型之間細胞分裂期前期(M1期)細胞分別為53.95%±2.81和46.94%±4.17，細胞分裂期后期(M2期)細胞分別為21.14%±2.53和29.83%±3.25。但Bcl-2的蛋白表達量和mRNA表達量沒有顯著差異。 結果表明，雖然蛋白磷酸酶2A的Cβ亞基的缺失并不會導致小鼠胚胎死亡，但Cβ亞基的缺失會輕微影響胚胎成纖維細胞(MEFs)的細胞周期。

關鍵詞：胚胎成纖維細胞；細胞凋亡；細胞周期

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是由細胞所處局部環(huán)境的生理性或病理性刺激引起的一種受基因調控的有序的細胞非炎癥性死亡，是基因調控下的一種主動性死亡過程，在調節(jié)細胞分裂及組織器官發(fā)育上起著重要的作用。Bcl-2家族是調控細胞凋亡關鍵的因子，其抑制凋亡是通過抑制細胞膜上脂質過氧化物的形成[1]，控制內質網(wǎng)上鈣離子的釋放[2]，降低線粒體膜通透性并增加其攝取鈣離子[3]，抑制細胞色素C釋放或直接抑制促凋亡因子[4]發(fā)揮作用的。

PP2A 是30多個絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一，其結構亞基A和催化亞基C各具有α和β異構體，具有4種不同的調節(jié)亞基家族，可以組成100多種不同的全酶，能使眾多底物去磷酸化，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡[5]，其中Cα的表達量為Cβ的10倍。PP2A蛋白表達量高，在有的細胞中能達到總蛋白的1%[6]。Cα基因(ppp2ca)敲除后小鼠胚胎無法正常發(fā)育，在胚胎期6.5 d(E6.5)死亡，而Cβ基因(ppp2cb)敲除后小鼠胚胎能正常發(fā)育并存活，無明顯可見表型[7]。PP2A的催化活性受到許多因素調節(jié)，如調節(jié)亞基、翻譯后修飾、抑制性蛋白質、第二信使和酶抑制劑等。神經(jīng)酰胺介導的細胞凋亡機制涉及1個線粒體PP2A對Bcl-2抗凋亡蛋白的去磷酸化和滅活作用，這個線粒體PP2A三聚體含有PR61α亞基，能直接作用于線粒體膜Bcl-2，使其去磷酸化，而神經(jīng)酰胺也能上調PR61α的表達并促進其向線粒體膜易位。因此PR61-PP2A在凋亡過程中起促進作用[7-8]。本研究通過流式細胞分選技術以及蛋白免疫印跡方法檢測了PP2A Cβ亞基敲除鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)的細胞周期分布、凋亡及抗凋亡因子Bcl-2的表達，探討了Cβ亞基在細胞凋亡的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑實時定量熒光PCR反應試劑盒為南京諾維贊公司產(chǎn)品；Trizol為TaKaRa公司產(chǎn)品；PI(Propidium iodide)染色液為Sigma公司產(chǎn)品；抗Cyclin D1抗體(#2922)、抗Bcl-2(#3498)抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；PP2A-C抗體(#80665)為Santa Cruz 公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2實驗動物PP2A Cβ亞基敲除鼠(敲除鼠)和同窩野生型對照鼠(野生型鼠)均來自于南京大學模式動物研究所。

1.2方法

1.2.1胚胎成纖維細胞制備將PP2ACβ+/-雄性小鼠與雌性小鼠以1∶2比例配對，配2籠，每天8點之前檢查小鼠陰道栓，見栓當天胚齡記為E0.5。取E12.5胚胎，將尾巴和四肢留作基因型鑒定用，去除頭及內臟，其余剪碎后用2.5 g/L的胰酶在37 ℃水浴中震蕩消化20 min，3 000 r/min離心3 min，去上清后用含100 mL/L FBS的DMEM重懸，均勻接種到6 cm培養(yǎng)皿中，次日換液。根據(jù)基因型鑒定結果留3個野生型鼠MEFs和3個Cβ基因敲除鼠MEFs作為試驗用，標記為P1代，此后每傳代1次，細胞代數(shù)加1，本試驗使用P3代細胞作為試驗對象。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期和凋亡取P3代胚胎成纖維細胞，胰酶消化后收集，計數(shù)，以1×106個細胞/100 μL的量加入FACS管。加1 mL PBS清洗細胞，500 r/min離心5 min，去上清。重復洗1次后用100 μL流式細胞染色緩沖液(含10 g/L BSA的PBS緩沖液)重懸細胞，加入10 μL PI染色液，混勻，冰上或者室溫避光孵育10 min~15 min。上機檢測。

1.2.3基因型鑒定及基因表達檢測用PCR和RT-PCR進行基因型鑒定。常規(guī)酚氯仿法抽提胚胎DNA，使用25 μL體系用引物Cb-Cred-F3/R3(表1)進行PCR擴增，59 ℃退火，35個循環(huán);產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用Trizol抽取胚胎RNA，去除基因組DNA后反轉錄為cDNA，以cDNA為模板用引物Ex345F/Ex3R2(表1)進行PCR擴增，58 ℃退火，20個循環(huán)；產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。熒光定量PCR檢測時以cDNA為模板，用SYBR Premix EXTaq體系進行擴增：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。引物為QBcl2-F/R，QCnnd1-F/R(表1)。收集細胞后用RIPA于4 ℃裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測定濃度后加入上樣緩沖液煮沸變性5 min，80 g/L的分離膠進行SDS-PAGE，100 V電泳90 min，濕法轉膜80 min后，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃過夜。TBST洗滌5 min，共3次，二抗室溫孵育1 h后洗膜并ECL顯影。

1.2.4統(tǒng)計分析應用Spss13.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1胚胎成纖維細胞(MEFs)制備和基因型鑒定

取E12.5的胚胎制作成MEFs，取胚胎尾巴及四肢提取DNA和RNA。以DNA為模版，用引物Cb-cred-F3/R3進行PCR擴增，產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，Cβ基因敲除鼠MEFs(ppp2cafl/flcb-/-)檢測到339 bp的條帶，而野生型鼠(ppp2cafl/flcb+/+)檢測到856 bp的條帶(圖1A)。將RNA反轉錄為cDNA，作為模板用引物Ex345F/Ex3R2進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，Cβ基因敲除鼠檢測到136 bp條帶，而野生型鼠檢測到310 bp的產(chǎn)物(圖1B)。在此基礎上，Western blot檢測胚胎成纖維細胞中PP2A蛋白的表達，純合子中PP2A蛋白表達量略有降低(圖1C、圖1D)。

表1　引物序列

2.2流式細胞分選技術檢測細胞凋亡和細胞周期

用PI染色后流式細胞分選技術檢測P3代MEFs細胞凋亡，其中PP2A Cβ敲除MEFs(ppp2cafl/flcb-/-)中凋亡細胞的比例為16.9%±1.36，而野生型MEFs(ppp2cafl/flcb+/+)中凋亡細胞的比例為14.4%±1.48，Cβ基因敲除的MEFs中比例略高于野生型MEFs(圖2A)。取P3代MEFs，用PI染色后流式細胞術檢測細胞周期分布情況，PP2A Cβ基因敲除MEFs中處于M1期的細胞比例為53.95%±2.81，處于M2期的細胞比例為21.14%±2.53；而野生型MEFs細胞周期中處于M1期的細胞比例為46.94%±4.17，處于M2期的細胞比例為29.83%±3.25(圖3)。PP2A Cβ基因敲除的MEFs處于M1期的細胞比例高于野生型細胞，而處于M2期的細胞比例低于野生型細胞。

2.3凋亡相關基因表達的檢測

Bcl-2(B-cell lymphoma-2)是Bcl2家族中關鍵蛋白，具有抑制多種細胞毒引起的細胞凋亡的功能。取P3代MEFs細胞提取RNA，用QPCR分析Bcl-2的表達,發(fā)現(xiàn)二者并沒有顯著性差異(圖4)。Western blot結果顯示,PP2A Cβ基因敲除MEFs和野生型MEFs之間Bcl-2蛋白表達量并無顯著差異(圖5)。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是由Cnnd1編碼的一個高度保守的蛋白，貫穿細胞周期的始終，是周期蛋白依賴性激酶關鍵調節(jié)因子，協(xié)助調控細胞周期進程。該基因突變后引起細胞向癌癥細胞轉化[10]。用QPCR分析發(fā)現(xiàn)Cnnd1基因的表達在Cβ基因敲除MEFs和野生型MEFs之間差異不顯著(圖4)。Western blot結果也顯示兩者之間Cyclin D1的蛋白表達量沒有顯著性差異(圖5)。

A．PCR鑒定MEFs Cβ基因敲除效率；B．RT-PCR鑒定MEFs Cβ基因敲除效率；C．Western blot鑒定MEFs PP2A敲除效率

1. 野生型MEFs(ppp2cafl/flcb+/+); 2. Cβ基因敲除MEFs(ppp2cafl/flcb-/-)

A. PCR amplification on the knockout efficiency of ppp2cb in MEFs with primers Cb-Cred-F3/R3; B. RT-PCR amplification on the knockout efficiency in MEFs with primers Ex345F/Ex3R2; C. Western blot analysis on the protein expression of PP2AC in knockout MEFs and the control; D. Density analysis on the western blot bands.

1 .Wildtype MEFs (ppp2cafl/flcb+/+); 2. Cβ knockout MEFs(ppp2cafl/flcb-/-)

圖1MEFs Cβ基因敲除效率鑒定

Fig.1Identification of Cβ gene knockout efficiency in MEFs

3討論

PP2A是一個廣泛性表達的蛋白，主要參與蛋白脫磷酸化過程，從而調控機體的各種生命活動，包括細胞周期和凋亡過程。細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂所經(jīng)歷的所有過程。包括間期和有絲分裂期。間期以DNA合成為標志，由G1期、S期和G2期構成，而M期是細胞分裂的主要階段，并形成新的細胞。這過程受到內源性“Cyclin-CDKs-CKIs”調控網(wǎng)絡的調節(jié)，從而完成器官和組織的發(fā)育。其中Cyclin為正向調控CDKs的關鍵因子，研究表明PP2A(Cdc55/B55)能夠調控Cyclin D1的轉錄過程[11]。細胞凋亡是由基因控制的細胞程序性自主死亡，用以調控其內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。細胞凋亡不同于細胞壞死，其表現(xiàn)為主動過程，包含了一系列基因的激活、表達及調控等，是機體為更好地適應生存環(huán)境而主動發(fā)揮的一種自體清理機制，整個過程受到多個基因的嚴格控制，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、促癌基因C-myc、抑癌基因P53等，其中Bcl-2是Bcl-2家族中的關鍵成員，能夠抑制細胞凋亡過程。有研究表明PP2A能夠通過去磷酸化作用調節(jié)Bcl-2的蛋白活性和降解[8，12-13]。

本研究結果顯示，利用E12.5的小鼠胚胎能夠用胰酶消化的方法成功獲得胚胎成纖維細胞，通過PCR方法鑒定獲取MEFs小鼠的ppp2cb大小。在DNA水平上確認了Cβ基因已經(jīng)被敲除。同時以cDNA為模板，利用RT-PCR方法鑒定發(fā)現(xiàn)Cβ基因在RNA水平上也被敲除掉了。最后利用Western blot技術在蛋白水平上驗證了Cβ基因的敲除情況。從圖1C中可以看出，純合子MEFs中PP2A的表達量低于野生型及ppp2cafl/flcb+/+的個體。這是由于Cα和Cβ蛋白僅在N端有3個氨基酸序列的差異，沒有特異性的抗體進行識別，而前者表達量是后者的10倍，冗余效應導致蛋白表達量檢測不能肯定敲除效率，但整體表達量的下降也表明敲除是有效的。

A. 流式細胞分選術檢測細胞凋亡的變化；B. MEFs細胞凋亡變化統(tǒng)計表

A. FACs analysis on alteration of MEFs cell apoptosis； B. Statistics on the variation of MEFs cell apoptosis

圖2流式細胞術檢測MEFs細胞凋亡

Fig.2Apoptosis analysis in MEFs checked by FACs

本研究中PI染色后流式檢測結果顯示，Cβ基因敲除MEFs中凋亡細胞的比例為16.9%±1.36，高于野生型MEFs中的14.4%±1.48，但差異不顯著(圖2B)。PP2A的缺失可能降低了Bcl-2的活性從而促進凋亡的發(fā)生，但本研究中Bcl-2的mRNA表達水平和蛋白表達水平均未觀察到顯著的差異，可能是其磷酸化程度的改變決定了Bcl-2的活性；同樣，在細胞周期檢測中，觀測到Cβ基因敲除MEFs中處于M1期的細胞比例為53.95%±2.81，處于M2期的細胞比例為21.14%±2.53；而野生型小鼠MEFs中處于M1期的細胞比例為46.94%±4.17，處于M2期的細胞比例為29.83%±3.25。從而可以推測Cβ基因的缺失輕微影響了細胞的周期分布，細胞周期的關鍵調控因子Cyclin D1的RNA和蛋白水平均未呈現(xiàn)出顯著差異，其總體表達水平并未受到影響，可能是其蛋白翻譯后修飾的磷酸化程度的改變。

A.流式細胞分選術檢測細胞周期的變化;B.MEFs細胞周期變化統(tǒng)計表

A.FACs analysis on alteration of MEFs cell cycle;B.Statistics on the variation of MEFs cell cycle

圖3流式細胞術檢測MEFs細胞周期分布

Fig.3Cell cycle distribution in MEFs detected by FACs

圖4　QPCR檢測Bcl-2和Cnnd1的表達

1-3.ppp2cafl/flcb+/+;5-6.ppp2cafl/flcb-/-

綜上所述，PP2A的Cβ基因雖然通常被認為并不重要，但本研究的結果顯示，Cβ基因的缺失能夠輕微影響胚胎成纖維細胞的周期和凋亡過程。對于其具體作用于哪種下游底物以及具體的作用機制尚需要進一步研究。

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Effects of Catalytic Subunit β of Protein Phosphatase 2A on Apoptosis of Embryonic Fibroblasts

WANG Qing-hua1,WANG Sheng-cun1,LI Bin2,LIU Chun1,WU Liu-cheng1,WANG Xu1,PENG Xiao-qing1, SHAO Yi-xiang1

(1.LaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China;2.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China)

Abstract:To investigate the effects of catalytic subunit β of protein phosphatase 2A (PP2A) on cell cycle and cell apoptosis in mouse embryo fibroblasts (MEFs)， the mouse embryos at E12.5 by mating the heterozygotes of Cβ subunit conventional knockout male and female mice at the ratio of 1∶2 were obtained. MEFs were prepared by trypsin digestion and genotyped by PCR, RT-PCR and Western blot to identify the genetic basis of each embryo. FACs was carried out to determine the cell apoptosis and cell cycle, meanwhile,the anti-apoptosis protein Bcl-2 was checked by Western blot. Genotyping by PCR, RT-PCR and Western blot showed that both knockout and wildtype MEFs were isolated by trypsin digestion at the ratio of 3∶3. The MEFs at M1 stage was 46.94%±4.17 and 53.95%±2.81, respectively and M2 stage was 29.83%±3.25 and 21.14%±2.53. There is no significant difference in cell apoptosis between wildtype and Cβ knockout MEFs and slight significant difference between wildtype and knockout MEFs in cell cycle.

Key words:mouse embryonic fibroblast; cell apoptosis; cell cycle

文章編號:1007-5038(2016)02-0064-06

中圖分類號:S852.33

文獻標識碼:A

作者簡介：王慶華(1978-)，男，江蘇泰州人，碩士研究生，主要從事實驗動物學及細胞生物學研究。*通訊作者

基金項目：江蘇省高校自然科學研究面上項目(11KJB180010；14KJB180018；15KJB180015)

收稿日期：2015-10-29