林思遠(yuǎn)，洪紹鋒，黃加濱，韋　瑩，陳　櫻，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室，廣西南寧 530005)

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PRRSV廣西分離株GXYL-1403全基因克隆與序列分析

林思遠(yuǎn)，洪紹鋒，黃加濱，韋瑩，陳櫻，黃偉堅(jiān)，韋祖樟*

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室，廣西南寧 530005)

摘要:對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所分離的1株豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403進(jìn)行全基因組克隆和序列分析。參考已發(fā)表的擴(kuò)增全長(zhǎng)PRRSV序列的13對(duì)特異性引物，用RT-PCR方法對(duì)病毒基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR片段克隆到pMD18-T載體上，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定。通過軟件對(duì)所擴(kuò)增序列進(jìn)行拼接，獲得GXYL-1403的全長(zhǎng)序列，并對(duì)GXYL-1403進(jìn)行比較和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明GXYL1403株基因序列全長(zhǎng)為15 018 bp，與國內(nèi)外多株P(guān)RRSV毒株進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，與VR-2332的相似性為89.1%，與TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性達(dá)到了97.9%~98.1%。另外，GXYL-1403分離株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特異的1+29個(gè)氨基酸的缺失。特別重要的是，在缺失29個(gè)氨基酸區(qū)域的上游，含有連續(xù)20個(gè)氨基酸缺失，在下游出現(xiàn)了連續(xù)74個(gè)氨基酸的缺失。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)美洲型PRRSV主要分為3個(gè)亞群，GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株屬于同一分支，證實(shí)了GXYL-1403株為美洲型PRRSV毒株。

關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒；克?。恍蛄蟹治?；遺傳進(jìn)化分析

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)的病原。不同年齡、品種和性別的豬均可感染，以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感，主要特征為母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎及仔豬呼吸困難、敗血癥、發(fā)育遲緩和高死亡率等[1]。PRRSV是一種單股、正鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，歸屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬。該病毒具有至少9個(gè)開放閱讀框架(ORF), 其中ORF1 包括ORF1a 和ORF1b , 主要編碼病毒的13個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp), 約占病毒基因組的80%。ORF2a、2b和3-5 編碼病毒的囊膜糖蛋白(GP2、E、GP3、GP4和GP5),ORF6編碼基質(zhì)蛋白(M),ORF7編碼病毒的核衣殼蛋白(N)。5′端有非編碼區(qū), 其作用是作為5′ 前導(dǎo)序列調(diào)節(jié)PRRSV 基因組RNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯, 從而介導(dǎo)各結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。在病毒基因組的3′末端也有一個(gè)非編碼區(qū), 其功能是作為病毒復(fù)制酶識(shí)別并結(jié)合的區(qū)域,以啟動(dòng)負(fù)鏈RNA的合成[2-3]。該病毒的歷史是由鼠的動(dòng)脈炎病毒(乳酸脫氫酶增高病毒-LDV)感染了中歐的野豬后產(chǎn)生的變異病毒，而后這些野豬被引進(jìn)美國。這些病毒在這兩大洲內(nèi)獨(dú)立變異和進(jìn)化，通過家豬和野豬的接觸，病毒進(jìn)入家豬群中，形成了后來的兩大獨(dú)立的豬藍(lán)耳病病毒原型，即歐洲型和美洲型。2個(gè)基因型的同源性在60%左右[3-5]。高致病性PRRSV目前已成為國內(nèi)的主要流行毒株。更多的研究表明PRRSV基因組在持續(xù)變異，很有必要對(duì)現(xiàn)行流行的PRRSV基因組進(jìn)行比較和遺傳進(jìn)化分析。通過對(duì)流行毒株的基因組特性和遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，為實(shí)施有針對(duì)性的免疫預(yù)防PRSSV提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒、細(xì)胞和菌株P(guān)RRSV毒株GXYL-1403為本實(shí)驗(yàn)室接收、分離、鑒定并保存。大腸埃希菌Dpα、Marc-l45細(xì)胞由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院家畜傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑新生胎牛血清、MEM為GIBCO公司產(chǎn)品；pMD18-T 載體、TaqMix、dNTP、Mixture、Trizol(RNA isolater)、RNase Inhibitor、M-MLV、LATaq酶等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA 凝膠回收試劑盒為Axyden Scientific公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成本研究使用的引物參考已發(fā)表文獻(xiàn)引物[6](表1)。

1.2.2病毒基因組RNA的提取、RT-PCR擴(kuò)增和克隆收取第3代病毒感染細(xì)胞后的上清液，參照說明書使用Trizol抽提病毒基因組RNA，所提取基因組RNA用20 μL 1 g/L DEPC水溶解。

表1　RT-PCR特異性引物

以病毒RNA作為模板，以12.5 μL的體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：8 μL RNA作為模板，dNTP(2.5 mmol/μL) 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200 U/μL) 0.25 μL，5×反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV buffer 2.5 μL，RNA酶抑制劑(40 U/μL) 0.25 μL，隨機(jī)引物(10 pmol/μL) 0.5 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h。將得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。

用cDNA 2 μL、10×LATaqPCR buffer(Mg2+free)2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/μL)4 μL、LATaq酶(5 U/μL)0.25 μL的作用下，以各引物對(duì)(PF1/PR1203、PF1154/PR2379、PF2108/PR4238、PF4070/PR5373、PF5349/PR6663、PF6574/PR7976、PF7894/PR9232、PF9122/PR10481、PF10378/PR11569、PF11322/PR12186、PF11759/PR13401、PF13138/PR14371、PF14231/PR15300)(10 pmol/μL)(表1)為引物，加雙蒸水補(bǔ)至25 μL的體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。對(duì)所獲得正確的DNA條帶進(jìn)行膠回收，再用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)膠回收產(chǎn)物，看其是否與PCR產(chǎn)物條帶一致。

將PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細(xì)胞，在37 ℃搖床3 h~4 h。之后在LA培養(yǎng)基中加入100 μL的菌液和40 μL的Amp+涂板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜。挑取5個(gè)單個(gè)菌落放入加有40 μL Amp+的5 mL LB試管中，在37 ℃搖床12 h，最后菌液PCR對(duì)電泳檢測(cè)的產(chǎn)物與引物長(zhǎng)度進(jìn)行比對(duì)，條帶正確的抽取1 mL送上海杰李生物有限公司測(cè)序。

1.2.3生物信息分析 對(duì)測(cè)序結(jié)果用Lasergene軟件進(jìn)行拼接，獲得GXYL-1403全基因組核苷酸序列。用DNA Star對(duì)毒株基因組進(jìn)行核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的比對(duì)分析。用MEGA5軟件對(duì)病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2結(jié)果

2.1序列測(cè)定和分析比較

收集GXYL-1403感染的Marc-145細(xì)胞上清液，用Trizol抽提病毒基因組RNA，對(duì)GXYL-1403的基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增和鑒定。接著克隆到載體，提取陽性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。用Seq Man對(duì)片段進(jìn)行拼接，得PRRSV毒株GXYL-1403全長(zhǎng)為15 018 bp。將GXYL-1403與其他13株P(guān)RRSV毒株(表2)序列相比(BJ-4、VR2332、LV、CH-1a、GD、HEB1、HN1、HUB1、HUB2、JXA1、S1、TJ和TP)，基因組全長(zhǎng)、各ORFs長(zhǎng)度結(jié)果見表3。GXYL-1403基因與其他代表株同源性比較見圖1。

如表3所示，GXYL1403的5′端UTR 含有189 bp，同其他高致病性PRRSV毒株一樣。所有毒株的3′端UTR除S1株為188 bp其余均為150 bp或151 bp。在參考的PRRSV毒株中，ORF1a的長(zhǎng)度變化是最大的，經(jīng)典毒株VR2332、S1、HN1和CH-1a 的ORF1a為7 512 bp，BJ-4 的ORF1a為7 509 bp。而高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株在ORF1a比VR2332少了90 bp，這是HP-PRRSV的遺傳特征即nsp2不連續(xù)缺失29+1個(gè)氨基酸。GXYL-1403株基因全長(zhǎng)為15 018 bp，比其他的參考對(duì)比毒株序列都要短，說明該毒株的基因組其他位點(diǎn)也存在缺失。而GXYL-1403株的ORF1a卻比VR2332少372 bp，也就是說缺失了124個(gè)氨基酸。從圖2可以看出GXYL-1403在nsp2高變區(qū)不連續(xù)缺失了123+1個(gè)氨基酸。其中，缺失的“1”同為圖中480位，HP-PRRSV毒株缺失的“29”為532-560位，而GXYL-1403缺失的“123”為512-634位，分別在“29”的上游有20個(gè)氨基酸缺失，“29”的下游有74個(gè)氨基酸缺失。由此可見，GXYL-1403株nsp2高變區(qū)的缺失部分相比于HP-PRRSV的經(jīng)典缺失部分有所擴(kuò)大。之后對(duì)其他的ORF進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GXYL-1403株在ORF1b、2～7的長(zhǎng)度與其他毒株一致，分別為4 383、771、765、537、603、525、372 bp。

對(duì)該毒株與其他13株經(jīng)典毒株進(jìn)行同源性比較(圖2)，發(fā)現(xiàn)GXYL-1403與美洲經(jīng)典株VR-2332同源性為89.1%，高于與歐洲經(jīng)典株LV的同源性60.9%，與TJ株同源性最高，達(dá)到了98.1%；與JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性也高達(dá)98%，與GD株的同源性也達(dá)到了97.9%。由此可見GXYL-1403株為HP-PRRSV毒株。

2.2遺傳進(jìn)化樹分析

為了解GXYL-1403株與其他PRRSV毒株之間基因的關(guān)系，基于病毒全基因組核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(圖3)，可將GXYL-1403株與國內(nèi)外PRRSV美洲型參考株分為3個(gè)亞群，GXYL-1403株和HP-PRRSV毒株如JXA1、HUB1、HUB2、TJ等在一個(gè)亞群中；經(jīng)典株VR-2332、BJ-4、S1等在1個(gè)亞群；在經(jīng)典毒株與高致病性毒株之間，又有1個(gè)亞群以CH-1a為代表。

表2　PRRSV毒株名稱及其來源

表3　GXYL-1403株與12株P(guān)RRSV毒株全基因組的長(zhǎng)度比較

圖1　GXYL-1403株與12株P(guān)RRSV毒株在nsp2高變區(qū)氨基酸序比較：

3討論

PRRSV有2個(gè)基因型，即VR-2332株為代表的美洲型Ⅱ型和以LV株為代表歐洲Ⅰ型，這兩者的基因序列的同源性僅為60%左右[7]。目前為止，我國分離鑒定的毒株多為Ⅱ型的PRRSV毒株。而Ⅱ型的PRRSV毒株又可分為3個(gè)亞群，第1個(gè)亞群以VR-2 332位代表，第2個(gè)亞群以CH-1a為代表，通過序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，確定我們分離的毒株是Ⅱ型PRRSV毒株，且是處于第3個(gè)亞群即高致病性PRRSV毒株(JXA1、TJ)，同亞群毒株全基因組對(duì)比同源性高達(dá)97.9%~98.1%。

PRRSV各個(gè)毒株基因組存在著廣泛的變異，特別是nsp2的基因變異最大，并且能夠耐受堿基的插入或缺失[8]。在2006年暴發(fā)的“高熱綜合征”后出現(xiàn)的在nsp2蛋白的29+1氨基酸缺失已經(jīng)成為了我國HP-PRRSV的標(biāo)志性特征。鄧雨修等人于2010年7月研究發(fā)現(xiàn)廣東PRRSV TM株除經(jīng)典缺失外，在22-42位有其他21位氨基酸的缺失[9]。劉飛等人的研究顯示貴州PRRSV GZZB株除經(jīng)典缺失外在395位還有1個(gè)氨基酸缺失，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)以GZMN株為代表的3株P(guān)RRSV序列除經(jīng)典缺失外在481位氨基酸的兩側(cè)還有29個(gè)氨基酸的缺失[10]。這些新型的缺失正在提示我們，在我國的南方地區(qū)PRRSV病毒基因組缺失有進(jìn)一步擴(kuò)大和加強(qiáng)的趨勢(shì)。然而也有研究表明，HP-PRRSV毒株29+1個(gè)氨基酸的缺失與病毒毒力強(qiáng)弱沒有關(guān)系[11]。在此次研究中發(fā)現(xiàn)，GXYL1403株唯一只有ORF1a基因全長(zhǎng)與對(duì)比參考毒株不同，其余片段則是一致的(表3)。重點(diǎn)分析該毒株nsp2片段(圖3)發(fā)現(xiàn)，PRRSV GXYL1403株的nsp2蛋白中不僅僅是29+1的氨基酸缺失了，而是123+1的氨基酸缺失，在缺失29個(gè)氨基酸區(qū)域的上游，含有連續(xù)20個(gè)氨基酸缺失，在下游出現(xiàn)了連續(xù)74個(gè)氨基酸的缺失，此缺失是在29個(gè)氨基酸缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)大形成的，這是否說明該毒株有進(jìn)一步的致病性變化，擴(kuò)大的缺失部分是否對(duì)病毒生物學(xué)特性有影響，均有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

圖2　GXYL-1403株基因與其他代表株的同源性比較 (%)

圖3　GXYL-1403株與部分PRRSV流行毒株的全基因遺傳進(jìn)化樹

在本研究中，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離到的PRRSV毒株GXYL-1403進(jìn)行了全基因序列分析、同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，確定了該毒株的來源與遺傳變異情況，同時(shí)也豐富了PRRSV分離株的全基因組序列數(shù)據(jù)庫，這對(duì)日后該病的流行病學(xué)調(diào)查提供了必要的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究nsp2氨基酸缺失對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis Full-length Genome of PRRSV Isolate GXYL1403 in Guangxi

LIN Si-yuan，HONG Shao-feng， HUANG Jia-bin，WEI Ying，CHEN Ying，HUANG Wei-jian，WEI Zu-zhang

(AnimalInfectiousDiseaseLaboratory,CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning，Guangxi，530005，China)

Abstract:To clone and analyse the full-length genome of a PRRSV strain GXYL-1403 isolated in our lab, 13 pairs of primers published were used for RT-PCR to amplify the full-length genome of GXYL-1409. The PCR fragments were cloned into pMD18-T vector. The amplicons were identified by emzyme digestion and further sequenced. The full-length genome was obtained through DNA splicing by DNAstar software. The phylogenic tree of GXYL1403 and the reference strains was constructed based on the full-length genome. The results showed that the complete genome of GXYL1403 consisted of 15 018 bp. The complete genome of GXYL-1403 shared 89.1% identity with VR-2332 and shared 97.9%-98.1% identity with HP-PRRSV strains TJ,JXA1,HEB1,HUB1,HUB2,TP. The phylogenic analysis based on the full-length genome revealed that PRRSV strains were classified into 3 subgroups and GXYL-1403 was confirmed as HP-PRRSV. It was suggested that GXYL1403 belongs to type II PRRSV. GXYL-1403 strain contained a deletion of 1+29 aa in nsp2 coding region. More importantly, GXYL-1403 strain contained a deletion of 20 aa in nsp2 coding region, which was located upstream of 29 aa deletion. Beside, a continuous deletion of 74 aa emerged following the 29 aa deletion in nsp2 region.

Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus；clone; sequence analysis； phylogenetic analysis

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0044-06

中圖分類號(hào):S852.659.6;Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：林思遠(yuǎn)(1992-)，男，四川自貢人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372444);廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目(XGZ130959)

收稿日期：2015-04-14