李　冰，牛建榮，周緒正，李劍勇，魏小娟，楊亞軍，劉希望，張繼瑜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

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復(fù)方板黃口服液制備工藝研究

李冰，牛建榮，周緒正，李劍勇，魏小娟，楊亞軍，劉希望，張繼瑜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

摘要:為確定復(fù)方板黃口服液的最佳制備工藝，采用正交試驗(yàn)等方法,對(duì)復(fù)方板黃口服液制備工藝各條件進(jìn)行優(yōu)選。確定的最佳工藝為藥材加純凈水浸漬12 h，煎煮2次，每次1 h，濾液80 ℃濃縮至藥液相對(duì)密度為1.18 g生藥/mL～1.25 g生藥/mL，醇沉2次(含醇量分別為600 mL/L和750 mL/L)，靜置24 h，回收乙醇，加純凈水定容。該制備工藝簡(jiǎn)便易行，質(zhì)量穩(wěn)定，可作為復(fù)方板黃口服液的最佳制備工藝。

關(guān)鍵詞:復(fù)方板黃口服液；制備工藝；正交試驗(yàn)

復(fù)方板黃口服液為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自主研制的獸用中藥復(fù)方制劑，由板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、知母及甘草等組成。方劑中板藍(lán)根清熱解毒，被臨床廣泛用于抗病毒、抗炎、增強(qiáng)免疫力等[1-3]，黃連、金銀花、黃芩具有清熱解毒的作用[1,4-5]；知母能清熱瀉火，滋陰潤(rùn)燥，涼血，消腫，利咽[1]；甘草補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，為調(diào)和諸藥[1]之用；諸藥合用，具有清熱解毒，燥濕，消腫，止血，利咽之功效，用于諸多瘟熱性疾病。獸醫(yī)臨床研究表明，該方對(duì)預(yù)防和治療畜禽類頑固性呼吸道感染類疾病，特別是雞、牛病毒和細(xì)菌等病原的混合感染療效滿意，具有高效，安全，低毒，臨床使用方便和無殘留的優(yōu)點(diǎn)。為確定科學(xué)合理、具有生產(chǎn)可行性的制備工藝條件，本研究采用正交試驗(yàn)[6]等方法進(jìn)行板黃口服液制備工藝的優(yōu)化，以確定其最佳制備工藝。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、山豆根、牛蒡子、桔梗、知母和甘草購(gòu)自蘭州黃河藥材市場(chǎng)；黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-200815)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-200911)為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；乙腈、甲醇(色譜純)為Fisher公司產(chǎn)品；工業(yè)乙醇為國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；950 mL/L乙醇，磷酸二氫鉀，十二烷基磺酸鈉，苯甲酸鈉，磷酸，均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

1.1.2儀器Waters2695-高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器為Waters公司產(chǎn)品；AEL-1600型電子天平為島津公司產(chǎn)品；純水系統(tǒng)為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；RE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海耀特儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1提取工藝考察

1.2.1.1浸泡時(shí)間對(duì)藥材吸水率的影響按處方量分別稱取板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、山豆根、牛蒡子、桔梗、知母和甘草，粉碎為粗粉入藥，置于燒杯中，加一定量水使完全浸沒藥材，室溫放置，于1、3、6、12、18 h各取出1份藥材，濾出未被吸收的全部水份，稱重后計(jì)算吸水率。

1.2.1.2水煎煮提取工藝確定影響水煎煮提取工藝的主要因素有A(加水量/倍)、B(提取時(shí)間/min)和C(提取次數(shù))，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)每個(gè)因素選擇3個(gè)水平考察，以2種主要有效成分鹽酸小檗堿和黃芩苷含量為考察指標(biāo)，直觀分析和方差分析，篩選穩(wěn)定、可行的提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交因素與水平

1.2.1.3提取工藝的驗(yàn)證按處方量(成方按1 kg用量計(jì))稱取板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、山豆根、牛蒡子、桔梗、知母和甘草3份，分別加7倍量水浸泡12 h后，水煎煮提取2次(第2次加5倍量水)，每次1 h，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。對(duì)所得樣品測(cè)定其鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量。

1.2.2醇沉工藝篩選水提液中含有大量的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多糖等成分，長(zhǎng)期放置容易析出沉淀，影響制劑的質(zhì)量，因此采用醇沉方法進(jìn)行純化處理[7]。本工藝以相對(duì)密度(g/mL)確定水提液的濃縮程度。以回收乙醇后制劑的澄清度，黃芩苷和鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)對(duì)醇沉工藝進(jìn)行篩選。

1.2.2.1濃縮程度篩選取各藥材(按處方量)，按照提取工藝確定的方法加水，浸泡，水煎提取，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至660、544、470、410、360 mL、即1 mL含生藥材分別為1.52、1.84、2.13、2.44、2.78 g，觀察濃縮液狀態(tài)，80 ℃測(cè)相對(duì)密度。

1.2.2.2醇濃度篩選將濃縮后的溶液分別分成6份，加入乙醇使醇濃度分別達(dá)到500、600、700、750、800、900 mL/L，充分?jǐn)嚢?，觀察沉淀物狀態(tài)，靜置，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至適量，加水定容，再次過濾，靜置，觀察溶液狀態(tài)，用高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定并計(jì)算鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率和黃芩苷轉(zhuǎn)移率。

1.2.2.3轉(zhuǎn)移率計(jì)算轉(zhuǎn)移率=(藥材含量×藥材量/相應(yīng)藥材成分提取含量×提取物量)×100%

2結(jié)果

2.1提取工藝篩選結(jié)果

2.1.1浸泡時(shí)間對(duì)藥材吸水率的影響藥材在浸泡12 h時(shí)吸水量達(dá)到飽和，吸水率為148.6 %，確定藥材的浸泡時(shí)間為12 h。結(jié)果見表2。

表2　浸泡時(shí)間對(duì)藥材吸水率的影響

2.1.2水煎煮提取工藝確定采用正交設(shè)計(jì)助手 V3.1.1版計(jì)算機(jī)軟件分析數(shù)據(jù)，按α=0.05水平，鹽酸小檗堿含量方差分析表明，煎煮時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿含量有顯著性影響(P<0.05)，煎煮60 min效果最好，加水量、煎煮次數(shù)無顯著性影響(表3)；直觀分析，極差值 RB > RC > RA(表4)。黃芩苷含量方差分析表明，各因素對(duì)黃芩苷含量都無顯著性影響(P<0.05)，煎煮60 min效果最好，加水量、煎煮次數(shù)無顯著性影響(表5)；直觀分析，極差值 RB > RC > RA。

根據(jù)以上結(jié)果分析并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定最佳提取工藝為加7倍量水，浸泡12 h，提取2次，提取時(shí)間1 h，第2次水煎煮提取時(shí)由于藥渣已含有一定量水分且體積減小，因此加5倍量水即可。

2.1.3提取工藝驗(yàn)證按照正交試驗(yàn)確定的提取工藝條件制備3批樣品，進(jìn)行鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測(cè)定。通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果比較，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量穩(wěn)定，RSD均小于2%，表明正交試驗(yàn)確定的提取工藝條件和方法穩(wěn)定、可行。結(jié)果見表6。

2.2醇沉工藝篩選結(jié)果

2.2.1濃縮程度篩選結(jié)果當(dāng)提取液濃縮至1 mL含生藥材2.78 g時(shí)，濃縮液黏稠掛壁嚴(yán)重，流動(dòng)性差，無法測(cè)定相對(duì)密度，因此確定提取液濃縮限度1 mL含生藥材2.13 g~2.44 g，即相對(duì)密度范圍為1.18 g~1.25 g/mL。結(jié)果見表7。

2.2.2醇濃度篩選結(jié)果乙醇濃度是影響醇沉效果的最主要因素，當(dāng)乙醇濃度為500 mL/L時(shí)，溶液沉淀清除不完全，溶液較渾濁、澄清度較差；當(dāng)乙醇濃度為600 mL/L時(shí)，溶液澄清度好，沉淀清除完全；當(dāng)乙醇濃度600 mL/L和700 mL/L時(shí)，溶液澄清，外觀性狀穩(wěn)定，但長(zhǎng)時(shí)間放置(3個(gè)月以上)會(huì)有沉淀析出；當(dāng)乙醇濃度為750、800、900 mL/L時(shí)，溶液澄清，外觀性狀穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間放置(3個(gè)月以上)肉眼觀察無沉淀析出。綜合試驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)成本考慮，確定以總醇度達(dá)60 %和75 % 2次梯度醇沉為宜。結(jié)果見表8。

2.3最佳處方工藝

經(jīng)過以上試驗(yàn)，確定復(fù)方板黃口服液的最佳制備工藝為：以上9味藥，加水浸漬12 h，煎煮2次，每次1 h，第1次加7倍量水，第2次加5倍量水，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.18 g/mL～1.25 g/mL(80 ℃測(cè))，冷至40 ℃時(shí)緩慢加入乙醇，使含醇量達(dá)600 mL/L，充分?jǐn)嚢?，靜置24 h，濾取上清液，回收乙醇至無醇味；再次加入乙醇，使含醇量達(dá)750 mL/L，充分?jǐn)嚢瑁o置24 h，濾取上清液，回收乙醇至無醇味，加苯甲酸鈉3 g，加水制成1 000 mL，攪勻，煮沸滅菌，無菌灌裝，即得。

表3　以鹽酸小檗堿含量考察的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：“* ”以煎煮時(shí)間為方差分析對(duì)照，F(xiàn)>F臨界值，P<0.05為差異顯著。

Note:"* "the decocting time as variance analysis control, F-ratio>critical value of F ,P<0.05 is significant difference.

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果

表5　以黃芩苷含量篩選的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：“* ”以煎煮時(shí)間為方差分析對(duì)照，F(xiàn)>F臨界值，P<0.05為差異顯著。

Note:"* "the decocting time as variance analysis control, F-ratio>critical value of F ,P<0.05 is significant difference.

表6　鹽酸小檗堿和黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

表7　濃縮狀態(tài)及相對(duì)密度

注：“-” 無法測(cè)定。

Note: "- "Can not be determined.

3討論

本處方由板藍(lán)根、黃連、金銀花、黃芩、山豆根、牛蒡子、桔梗、知母及甘草等九味藥組成。黃連、黃芩清熱解毒為君藥，鹽酸小檗堿為黃連根莖中所含的一種主要生物堿[8]控制黃連質(zhì)量多選用鹽酸小檗堿作為指標(biāo)成分[9]，控制黃芩質(zhì)量多選用黃芩苷作為指標(biāo)成分[10]。為了充分監(jiān)測(cè)2味藥的提取效果，考察提取工藝的穩(wěn)定性，分別以2種主要有效成分鹽酸小檗堿和黃芩苷作為指標(biāo)成分，通過高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定其含量，方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠。

板黃口服液處方中黃連與甘草、金銀花、黃芩等配伍。在《傷寒論》中，與黃連相配最多的2味藥即是黃芩和甘草,占全部含黃連方劑的25.0%，其中黃連和黃芩配伍方劑大約占20%～60%[5]，《漢備急千金要方》中占12.35%，《汪外臺(tái)秘要》中占6.15%，《太平圣惠方》中占12.35%，根據(jù)張明明等[11]報(bào)道，小檗堿或黃連與甘草、大黃、金銀花、黃芩配伍后，其水煎液中的小檗堿或黃連總生物堿的含量均顯著降低[12]，其中與黃芩配伍的水煎液中的損失最多[13]。另外，黃連與甘草的配伍屬于沉淀性配伍[14-15]，黃連與甘草合煎產(chǎn)生的沉淀可溶于人工胃液，微溶于人工腸液，而通常湯液過濾操作并不能完全除去這類沉淀，在體內(nèi)，這些沉淀中的小檗堿還有可能發(fā)揮藥效[4]。在板黃口服液的工藝優(yōu)化過程中，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率始終不高于0.64%，主要與處方配伍有關(guān)。綜合工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果和藥效試驗(yàn)[16-17]結(jié)果，鹽酸

表8　醇沉試驗(yàn)結(jié)果

小檗堿的含量限度與按黃連投料量的折算差異不影響本工藝選擇的合理性。

本研究確定的復(fù)方板黃口服液制備工藝簡(jiǎn)便，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制。本研究通過驗(yàn)證試驗(yàn)及放大批次生產(chǎn)表明制備工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定、可行，可作為復(fù)方板黃口服液的最佳制備工藝。

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Study on Preparation Technology of Compound Banhuang Oral Liquid

LI Bing,NIU Jian-rong,ZHOU Xu-zheng,LI Jian-yong,WEI Xiao-juan,YANG Ya-jun,LIU Xi-wang,ZHANG Ji-yu

(LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDevelopment,MinistryofAgriculture;KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

Abstract:To define the optimal conditions of preparation technology of Banhuang compound oral liquid,the conditions were screened by using some methods such as orthogonal test. The optimum conditions are as follows: soaking time of the medicinal is 12 h, decoction time is 1 h for twice, the relative density of the concentrated solution is 1.18 g/mL-1.25 g/mL, ethanol precipitating twice and the density of the ethanol precipitation is 600 mL/L and 750 mL/L respectively, standing time is 24 h. The results of the optimizated preparation process showed that the preparation process of Banhuang oral liquid is stable, simple and suitable for prepartion.

Key words:Banhuang oral liquid；preparation technology；orthogonal test

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0015-04

中圖分類號(hào):S853.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：李冰(1981-)，女，甘肅蘭州人，助理研究員，碩士，主要從事獸用藥物制備與分析工作。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(CARS-38)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(301303038-4)

收稿日期：2015-05-11