張 鑫 肖 琎 周 鑫 張思宇 張立田 劉 洋

（唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北唐山 063000）

高效液相色譜法測(cè)定奶牛飼料中苯甲酸的方法研究

張 鑫 肖 琎 周 鑫 張思宇 張立田 劉 洋

（唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北唐山 063000）

本實(shí)驗(yàn)建立了奶牛飼料中苯甲酸含量測(cè)定的高效液相色譜法，樣品經(jīng)甲醇溶液提取、C18固相萃取柱凈化后，高效液相色譜分離測(cè)定。對(duì)粗料、精料以及TMR日糧的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率均在72.77～92.94%之間，相對(duì)偏差1.74～3.06%之間。本方法具有操作靈敏度高，凈化效果好，適用范圍廣等特點(diǎn)，完全能夠滿足奶牛飼料中苯甲酸檢測(cè)的需要。

飼料；苯甲酸；高效液相色譜法；固相萃取

苯甲酸是具有鱗片狀或針狀結(jié)晶的物質(zhì)，以游離酸、酯或其衍生物的形式廣泛存在于自然界中，是一種常見的飼料防腐劑。苯甲酸通過抑制細(xì)菌及霉菌等微生物細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的吸收，并抑制細(xì)胞的呼吸酶系的活性，從而達(dá)到防腐的作用。[1]而奶牛飼料一般由粗料、精料和其他添加劑混合而成，成分復(fù)雜，對(duì)飼料中苯甲酸檢測(cè)造成了一定的困難。本方法對(duì)粗料、精料以及TMR日糧中的苯甲酸分別進(jìn)行了研究，旨在研發(fā)出一種準(zhǔn)確，靈敏的檢測(cè)方法，滿足日常檢測(cè)的需要。

1 材料和方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀，島津公司LC-20AT配紫外檢測(cè)器；電子天平，Sartorius公司；振蕩器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試劑

甲醇，HPLC級(jí)，ACS公司；亞鐵氰化鉀，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸鋅，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.E；500mg/6mlC18固相萃取小柱，迪馬科技。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ODS-SP 250mm×4.6mm 5μ m，流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（pH=6.7）+甲醇=90+10，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm，進(jìn)樣量20μ l。

1.4 樣品處理

稱取3.00g樣品至50ml離心管中，加入5mol/L氫氧化鈉溶液1ml、20%甲醇20ml，渦旋混勻，振蕩提取20min，再加入92g/L亞鐵氰化鉀2ml，183g/L乙酸鋅2ml，混勻，5000r/min離心5min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH值至3備用。C18固相萃取柱用甲醇5ml、水5ml活化，取5mL提取液過柱，5ml水淋洗，3ml 60%甲醇洗脫，洗脫液過0.45μ m濾膜上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳波長(zhǎng)的測(cè)定

取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于 190～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯甲酸在230nm附近有最大吸收，故選擇230nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

通過對(duì)文獻(xiàn)的查閱[2-4]，本方法選擇了C18固相萃取柱凈化樣品。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取液的pH對(duì)固相萃取柱的過柱效果有影響。我們選擇了不同pH值的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為中性是C18固相萃取柱對(duì)苯甲酸的保留為0，回收率為0；而酸性環(huán)境下C18固相萃取柱對(duì)苯甲酸的保留增強(qiáng)，見表1。從表中可以看出，pH值為2和pH值為3的回收率接近，且為最高，但低pH值會(huì)對(duì)C18固相萃取柱有損壞，最終我們選擇了pH值為3時(shí)進(jìn)行固相萃取。

圖1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白加標(biāo)色譜圖

圖3 空白樣品色譜圖

表1 不同pH值下固相萃取的回收率

2.4 線性范圍及最低檢測(cè)限

配制濃度分別為1.0μ g/ml、5.0μ g/ml、10.0μ g/ml、25.0μ g/ ml、50.0μ g/ml、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行色譜分析，以苯甲酸含量Y（μ g/ml）對(duì)峰面積X作圖，得出苯甲酸回歸方程Y=2.52×10-5X-0.14，相關(guān)系數(shù)r為0.9999。

2.5 方法測(cè)定低限的確定

對(duì)空白樣品進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定，按照3倍信噪比計(jì)算，得出方法測(cè)定低限均為5mg/kg。

2.6 精密度回收率

我們對(duì)奶牛配合飼料、青貯飼料、TMR日糧進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為5μ g/kg、10μ g/kg、50μ g/kg，即為方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低限，依照樣品處理方法測(cè)定，回收率及相對(duì)偏差見表。從表可見，3個(gè)加標(biāo)濃度的苯甲酸在3種飼料中均有良好回收率和相對(duì)偏差。

張?chǎng)危?983—），女，河北唐山人，碩士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。