GST-endostatin重組表達(dá)及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用研究

周雨霏 陳珊宇 戴明明

目的利用分子生物學(xué)手段重組表達(dá)endostatin，提高endostatin抑制腫瘤細(xì)胞的作用。方法利用RT-PCR 從老鼠的肝臟中取得endostatin的 cDNA，經(jīng)過 DNA 測(cè)序確定后 ，將它植入載體并表達(dá)產(chǎn)生大量的重組蛋白質(zhì)（GST-endostatin）。以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，通過將表達(dá)重組的GST-endostatin與HeLa細(xì)胞作用，研究其對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果重組表達(dá)GST-endostatin分子量約為46 kDa，產(chǎn)量約為1．5 mg/L。研究結(jié)果表明，GST-endostatin可以在20 nM 的濃度抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)50%。結(jié)論該重組表達(dá)GST-endostatin可溶性強(qiáng)，對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用明顯，是一種較好的抗血管生成抑制劑，但其抑制HeLa細(xì)胞增生的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

GST-endostatin；抗腫瘤；外源表達(dá)

利用抗血管生成的方式來治療癌癥，因其具有作用廣泛、低毒性以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起越來越多的應(yīng)用。在新進(jìn)增加種類的抗血管生成抑制劑中，內(nèi)皮抑素（endostatin） 是最受到注目的一種，其直接以內(nèi)皮細(xì)胞做為治療目標(biāo)，較不易引起細(xì)胞抗藥性的發(fā)生。如同 血管抑制素（angiostatin）或抗血管生成抑制劑（vasostatin），endostatin是細(xì)胞外膠原蛋白 XVIII（collagen XVIII）經(jīng)過蛋白質(zhì)水解脢作用后的一個(gè)片段 （約為20 kDa）。它能有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生與血管的生成，但是對(duì)癌細(xì)胞本身卻不具任何毒殺效果［1］。先前實(shí)驗(yàn)利用遺傳工程生產(chǎn)出末端組氨酸修飾恩度（His-tagged endostatin）并定期注射治療帶有腫瘤生長(zhǎng)的老鼠，能導(dǎo)致腫瘤的萎縮并使腫瘤細(xì)胞處于休眠期，而這整個(gè)治療過程并不會(huì)導(dǎo)致抗藥性的發(fā)生［2］。但是受Histagged endostatin溶解性低限制，該融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用也受到相應(yīng)限制［3-4］。為此我們將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase）與目標(biāo)蛋白做成融合蛋白的方式在外源表達(dá)，從而達(dá)到增強(qiáng)溶解性的目的。

本研究利用RT-PCR 從老鼠的肝臟中取得endostatin的 cDNA，經(jīng)過 DNA 測(cè)序確定后，將它植入載體并表達(dá)產(chǎn)生大量的重組蛋白質(zhì)（GST-endostatin）。并以HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，通過將表達(dá)重組的GST-endostatin與HeLa細(xì)胞作用，研究其對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 總RNA提取、純化及cDNA的合成

由老鼠肝臟將其磨碎使用動(dòng)物組織RNA抽提試劑盒提取總RNA、并純化；利用逆轉(zhuǎn)錄酶（Gibco）先將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

1.2 RT-PCR 擴(kuò)增 endostatin 基因

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA，再利用PCR將 endostatin基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物由takara合成，序列為： primer sense：5’-CGCGGA T CCATGCATACTCATCAGGACTTTCAGC-CAGTGCTC-3’；primer reverse ：5’CCCGTCGACCTA TT-TGGAGAAAGAGGTCA TGAAGCTA TT-3’。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延長(zhǎng)5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件：使用電壓80 V，電泳時(shí)間40 min。

1.3 在大腸桿菌中表達(dá)并純化重組的endostatin

選用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）-pGEX-2TKcs表達(dá)載體，將endostatin的DNA片段連接到該質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)入BL21宿主細(xì)胞中使其表達(dá)。先取1 L的LB加入10 ml GST-endostatin/BL21）菌液，37℃培養(yǎng)，待菌液OD值達(dá)到0.5～0.8，加入IPTG（100μM）后將菌液至于30℃的培養(yǎng)箱中3～4 h，5 000 rpm離心5 min，取沉淀加入35 ml NETN重新混勻，并加入溶菌酶（0.5 mg/ml），再利用弗氏細(xì)胞壓碎器將其打碎；最后利用高速離心機(jī)，9 000 rpm、 10 min收取上清液。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析純化后，得到了純度較高的GST-endostatin蛋白。將GST-endostatin蛋白SDS-PAGE電泳驗(yàn)證分子量大小及純度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活性測(cè)定

HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，由本實(shí)驗(yàn)室凍存?zhèn)溆茫?jīng)復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10 μg/ml）GST-endostatin作用培養(yǎng)，用WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 endostatin 基因擴(kuò)增

經(jīng)過RT-PCR后，以1%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段大小。如圖1所示，所得的RT-PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期endostatin的552 bp相當(dāng)。

圖1 endostatin基因電泳圖

2.2 GST-endostatin 蛋白表達(dá)

將endostatin DNA片段轉(zhuǎn)入帶有GST的質(zhì)粒（pGEX-2TKcs），并將它送入BL-21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析純化得到目標(biāo)蛋白。以蛋白質(zhì)電泳分析所得的GST-endostatin在SDS-PAGE分子量約為46 kDa，而在無SDS情況下形成聚合分子（圖2）。且其產(chǎn)量也由報(bào)道的0.3～0.4 mg/L，提升至大約1.5 mg/L。

2.3 GST-endostatin對(duì)HeLa細(xì)胞活性的影響

取約5×103個(gè)HeLa細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的GST-endostatin（或GST）處理；經(jīng)過48 h后加入WST-1，利用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光值。結(jié)果如圖3所示，經(jīng)GST-endostatin處理的細(xì)胞，隨處理的濃度增高，其細(xì)胞的生長(zhǎng)速率被抑制的越嚴(yán)重，而經(jīng)GST處理的對(duì)照組，則沒有任何抑制效果。而且從本圖中，也可以明顯看見，IC50約為20 nM。

圖2 GST-endostatin蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

圖3 GST-endostatin對(duì)HeLa細(xì)胞活性的影響

3 討論

利用抗血管生成的方式來治療癌癥，因其具有作用廣泛、低毒性以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究的熱點(diǎn)［5］。截至目前為止，已被找到的抗血管生成抑制劑主要有血管抑素（Angiostatin）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）、血小板反應(yīng)素（TSP）和MMP的組織抑制劑等20余種，其中endostatin應(yīng)用日益廣泛［6-7］。

本研究在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中則可以得到大量GST-endostatin目標(biāo)蛋白。GST-endostatin在水溶性與效應(yīng)上均優(yōu)于His-tagged endostatin，原因可能與GST修飾后增加其水溶性與促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊有關(guān)。在GST-endostatin對(duì)細(xì)胞增生抑制的實(shí)驗(yàn)中（圖3），我們也發(fā)現(xiàn)IC50由報(bào)導(dǎo)的50 nM下降至21.7 nM，抑制效能明顯地提升兩倍?？赡苁且?yàn)閑ndostatin的N-terminal 與GST結(jié)合，因而造成整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而增強(qiáng)抑制效用。

研究指出endostatin氨基酸序列的N端，組氨酸1，3，11和天冬氨酸76的位置有一個(gè) Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)，且這個(gè)Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于抑制血管生成是必須的；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這幾個(gè)位點(diǎn)變異的endostatin無法抑制Lewis肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而在氨基酸序列的C端，則有一個(gè)肝磷脂的結(jié)合位點(diǎn)［8］。有研究結(jié)果指出：利用EBNA-293細(xì)胞產(chǎn)生的endostatin，可以在雞蛋絨毛尿囊膜上抑制由bFGF和VEGF誘發(fā)的血管生成過程。但是GST-endostatin抑制血管生成的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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［2］ 姜蕊，趙春明，宋美娟，等． 恩度對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)及機(jī)制探討［J］． 山東醫(yī)藥，2011，51（46）：19-21．

［3］ 張曉明，余建，黃學(xué)應(yīng)，等． 重組人內(nèi)抑素對(duì)兔耳創(chuàng)面瘢痕組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］． 解剖學(xué)報(bào)，2015，46（1）：101-105．

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Recombinant Expression of GST-endostatin and its Inhibitory Effect on the Growth of Cervical Carcinoma HeLa Cells

ZHOU Yufei CHEN Shanyu DAI Mingming Radiology Department，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361002，China

ObjectiveIn order to improve the effect of endostatin on the inhibition of tumor cells，using molecular biology means to redo the expression of endostatin．MethodsTotal RNA was extracted from mouse liver，reverse transcription cDNA． Endostatin gene was amplified by PCR，and the fragment was implanted into vector and expressed to produce a large number of recombinant protein（GST-endostatin）．In order to study the inhibitory effect on HeLa cells，the expression of GST-endostatin and HeLa cells in cervical cancer cells was studied．ResultsThe GST-endostatin molecular weight was about 46 kDa，and the yield was about 1．5 mg/L． The results showed that GST-endostatin could inhibit the growth rate of Hela at 20 nM with a concentration of 50%．ConclusionThe recombinant expression of GST-endostatin is a good anti angiogenesis inhibitor，and it is a good anti angiogenesis inhibitor，but it needs further research on the mechanism of inhibiting HeLa cell proliferation．

GST-endostatin，Anti-tumor，Expression

R737．33

A

1674-9316（2016）36-0170-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．36．100

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，福建 廈門 361002

戴明明，E-mail：dmmxmdx@sina．com