魏　強　王　莉　崔林虎

（吉林省通化市種子管理站，通化134000）

RNA干擾技術在育種方面的應用

魏強王莉崔林虎

（吉林省通化市種子管理站，通化134000）

RNA干擾（RNAi，RNA inference）即雙鏈微小RNA片段能使其同源的mRNA發(fā)生特異性降解，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的手段［1］，這種模式廣泛存在于動物、植物和真菌中。這種新興的RNA干擾技術是分子水平的轉(zhuǎn)基因育種重要手段之一，具有育種年限短、定向改良品種等多項優(yōu)勢。本文概述了RNAi的研究歷史，對RNA介導的轉(zhuǎn)基因沉默的機制、特點和實施方法等進行了概括，并對其在農(nóng)業(yè)方面的應用進行了闡述。

RNAi；轉(zhuǎn)基因育種；基因沉默

面臨著日益增長的人口，耕地面積不斷減少的今天，糧食問題成為解決生計的重要課題之一，不斷地培育出優(yōu)良新品種是解決糧食問題的重要手段之一。然而傳統(tǒng)育種有著育種周期長、種質(zhì)資源有限、占用過多的人力、物力等弊端，而轉(zhuǎn)基因育種是當前最為快捷的育種方式，育種周期短、特異性強。RNAi技術在過去的10年中得到廣泛的研究，是當今最熱門的研究項目之一。RNAi技術的出現(xiàn)給轉(zhuǎn)基因育種提供了新的手段和方法，能夠特異性的繁育品種，在轉(zhuǎn)錄后水平上特異性地控制某個性狀表達，從而起到改良品種的作用。RNAi技術已在馬鈴薯、水稻、小麥等作物中得到成功應用。

1　RNAi技術的研究發(fā)現(xiàn)

20世紀90年代初，N．Romano等［2］通過增加基因拷貝數(shù)來增強矮牽牛花紫色色素的表達，不僅沒有達到預期開紫花的效果，反而部分或全部開白顏色花，由此推斷其色素合成的機制被干擾或者關閉，他們將這一機制定義為共抑制。C．Cogoni等［3］1994年發(fā)現(xiàn)外源類胡蘿卜素基因?qū)腈滄呙怪?，其?nèi)源的類胡蘿卜素表達量下降，他們將這種現(xiàn)象稱為消除作用。1995年S.Guo等［4］在利用反義干擾技術探究線蟲的基因功能時，發(fā)現(xiàn)無論是正義片段還是反義片段均能阻礙靶向Par-1基因的表達。1998年A.Fire等［5］發(fā)現(xiàn)正義片段能起到干擾作用是因為混入了反義片段，并首次將靶向Par-1基因正、反義片段同時轉(zhuǎn)入線蟲卵中，發(fā)現(xiàn)其干擾抑制作用比單獨反義片段強100倍，并由此提出RNAi的概念，從此掀起RNAi技術研究熱潮。隨著不斷的探索，果蠅、擬南芥、小鼠等均存在這種干擾抑制現(xiàn)象，并且普遍在動物、植物和真菌中均有體現(xiàn)。隨著RNAi技術的不斷研究，人們開始逐漸意識到RNAi技術在功能基因組的開發(fā)研究、藥物研發(fā)、動植物育種等方面的研究上有著尤為重要的意義。

2　RNAi的作用機制

這些年來，對RNAi的干擾機制有很多研究，最有說服力的研究是基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應。在多種酶的共同參與下，轉(zhuǎn)錄后的信使RNA（mRNA）被特異性地切成小片段，從而達到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效果。

2.1啟動階段起始過程是進入細胞的dsRNA（doublestranded RNA）被Dicer酶識別并特異性地切割成21～25個核苷酸片段（nt）的siRNA（small interfering RNA）。后者與其結合的靶向mRNA的序列具有同源性，siRNA的2個單鏈為21～23nt的小片斷，其中位于最后的5′末端為磷酸基，3′末端為羥基并帶有2個突出的核苷酸。此結構說明siRNA是通過RNaseIII剪切長dsRNA所產(chǎn)生，且具有RNaseIII剪切反應的所有特征。

2.2效應階段細胞中含有一種由解旋酶、核酸內(nèi)切酶、外切酶等構成的蛋白復合物，是效應階段的主要參與物質(zhì)，siRNA在解旋酶的作用下將雙鏈打開，并形成單獨的正義片段和反義片段，其中反義片段與蛋白復合物相結合，E.Bernstein等［6］將此復合物命名為RNA誘導的沉默復合物（RISC，RNA induced silencing complex）。活化后的RISC能夠特異性識別mRNA，通過堿基互補配對與其結合，而后在核酸內(nèi)切酶的作用下特異性地將mRNA切割成12～23nt的小片段，達到轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達。

2.3擴增階段21世紀初，C.Lipardi等［7］對果蠅胚胎進行提取，研究發(fā)現(xiàn)siRNA不僅可以抑制靶基因表達，還可以作為引物，以mRNA為模板，由RNA聚合酶（RdRP，RNA dependent RNA polymerase）進行催化，產(chǎn)生更多的dsRNA，而這些dsRNA能被完全切成siRNA，完成一次擴增循環(huán)，通過這樣的擴增機制能使得RNAi效應逐漸被放大，因此只要少量的dsRNA就能完成RNAi作用。

3　RNAi的作用特點

3.1高特異性研究發(fā)現(xiàn)siRNA進行序列識別時只有正義鏈3′端的2個堿基不起主要作用，位于siRNA序列中的其他堿基只要有1nt的堿基發(fā)生突變，其對基因的抑制作用就會消失，因此RNAi可以靶向定位mRNA使其相應基因表達沉默，對于非特異性基因不發(fā)生反應。

3.2高效性注入細胞內(nèi)的少量dsRNA會通過擴增階段獲得大量的dsRNA，由此產(chǎn)生更強的作用。

3.3RNAi的選擇性外源性dsRNA只對成熟mRNA產(chǎn)生作用，對mRNA前體沒有或很少具有影響。

3.4RNAi的時效性研究發(fā)現(xiàn)RNAi在較為低等生物中可以持續(xù)作用，但是在哺乳動物的細胞中卻只能作用較短時間，并且它的作用強弱與dsRNA的起始含量有關，不斷地注入dsRNA才能產(chǎn)生持續(xù)沉默效應。

3.5可傳播性和可遺傳性細胞壁和細胞膜無法阻礙RNAi的作用機制，能夠在細胞與細胞之間進行傳遞，不受細胞束縛。在線蟲中，這種干涉效應僅僅可以遺傳給子1代，往后會變成野生型。

4　作物中RNAi的誘導方法

RNAi的誘導方法有多種，例如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、高速粒子炮轟法、病毒介導轉(zhuǎn)化法（VIGS）等，這些方法是植物誘導常用方法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化介導法具有操作簡單、快捷、廉價等優(yōu)點，通常使用根瘤農(nóng)桿菌介導dsRNA轉(zhuǎn)化到植物細胞中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法包括電擊穿孔法、聚乙二醇介導法等，它適用于多種作物和植物，其缺點是轉(zhuǎn)化時間長，不適于基因功能的大量鑒定。高速粒子炮轟法轉(zhuǎn)化周期短但是轉(zhuǎn)化效率底。病毒介導法將攜帶dsRNA的病毒侵入植物宿主細胞內(nèi)，通過病毒的復制來擴增和擴散dsRNA，從而來介導轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。

5　RNAi技術在育種方面的應用

傳統(tǒng)育種通常采用雜交、回交等育種方法，不僅受到種質(zhì)資源的限制，并且育種周期長，改良效果有限。RNAi技術彌補了傳統(tǒng)育種上的不足，不僅可以縮短育種年限，而且能夠定向改良作物品質(zhì)。

5.1在測定基因功能方面RNAi技術為水稻和擬南芥的基因功能測定提供了高效、快捷的途徑。D.Miki等［8］利用RNAi工具分析保守型作物多基因家族。李小平等［9］應用RNA干擾技術證明了rlpk2基因是大豆中調(diào)控衰老的相關基因。H.Kumagai等［10］在應用RNA干擾技術對FNOD40基因的研究中發(fā)現(xiàn)FNOD40基

因關系到根瘤的生成和生長。

5.2在植物抗病性方面通過將水稻黃斑病毒（RYMV）復制所必須的酶基因?qū)胨荆肦NAi機制培育出具有RYMV抗性的水稻［11］。趙明敏等［12］應用RNAi技術成功抑制煙草花葉病毒（TMV，Tobscco mosaic virus）表達。

5.3在改良作物營養(yǎng)價值方面的應用萬群［13］將番茄紅素的環(huán)化酶基因siRNA干擾序列轉(zhuǎn)化入番茄中，得到的番茄紅素是普通的2.1倍。柴曉杰等［14］采用RNAi方法使得玉米支鏈淀粉含量下降。馬建［15］應用RNAi手段使得大豆脂肪氧化酶的表達量下降了。Q.Liu等［16］利用RNAi技術，以棉花子粒中2種關鍵酶的基因為模板，設計外源dsRNA導入棉花子粒，使目標基因發(fā)生沉默效應，使油酸在棉花子油中的比例提高到77%，硬脂酸比例提高至40%，獲得了2種酸含量較高的轉(zhuǎn)化植株，并最終雜交獲得了高油酸和高硬脂酸的棉花植株，成功對棉花子油的成分實施改良。

6　結束語

近10多年來RNAi技術的興起應用到各行各業(yè)中，為農(nóng)業(yè)育種、藥物研發(fā)、功能基因組的鑒定等提供了有力的工具，尤其是其特異性強、效率高等優(yōu)良特性在農(nóng)業(yè)育種方面得到了廣泛的應用，彌補了傳統(tǒng)育種上由于種質(zhì)資源有限和育種年限長給農(nóng)業(yè)育種方面帶來的困擾。通過RNAi技術能夠在明確基因功能的基礎上定向改良品種，節(jié)省了大量的人力、物力和財力。隨著對RNAi技術認識和研究的不斷加深，會在各個領域給人們帶來新的福利。

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