于新友，李天芝，梅建國，沈志強

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

傳染性法氏囊病病毒分子生物學(xué)研究進展*

于新友1，李天芝1，梅建國2，沈志強2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

本文介紹了傳染性法氏囊病病毒基因組結(jié)構(gòu)特點，論述了傳染性法氏囊病病毒分子生物學(xué)診斷方法，包括常規(guī)PCR方法、PCR-RFLP方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等，并就其基因工程疫苗方面的研究進行了著重闡述。

傳染性法氏囊病病毒；基因組；分子生物學(xué)診斷；基因工程疫苗

雞傳染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)可引起雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)，該病是一種急性、高度接觸傳染性、殺淋巴細胞性傳染病[1]。

IBDV主要侵害法氏囊的B前淋巴細胞，導(dǎo)致法氏囊器官萎縮。其結(jié)果不僅直接引起感染雞的發(fā)病和死亡，而且可導(dǎo)致雞的免疫抑制，間接引起其他致病因子的感染以及雞對疫苗免疫的應(yīng)答能力下降[2]。免疫抑制、抗原變異，特別是超強毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，使IBD的防控形勢更加嚴峻，國際獸疫局將 IBD列為 “影響社會經(jīng)濟的重要疾病”。IBDV是雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬成員，基因組由兩個雙股RNA節(jié)段組成，共編碼VP1、VP2、VP3、VP4和VP5等5個蛋白，其中VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白[3]。國內(nèi)外專家學(xué)者在IBDV分子生物學(xué)方面進行了大量研究，現(xiàn)就研究情況進行綜述，旨在為IBDV防控提供參考。

1 基因組結(jié)構(gòu)與特點

1.1 編碼區(qū)與非編碼區(qū) IBDV基因組是由A、B雙股RNA片段構(gòu)成，分別為A片段(大片段)和B片段(小片段)，A片段長約3.2～3.4kb，含有兩個開放閱讀框ORFA1(約3096bp)和ORFA2(約436bp)，ORFA2在前，ORFA1在后，ORFA2與ORFA1的5′端重疊，編碼VP5蛋白，ORFA1則編碼一個約110 KD的多聚前體蛋白 (NH2-VP2-VP4-VP3-COOH)，前體蛋白經(jīng)相關(guān)酶變?yōu)閂P2前體pVP2以及VP3和VP4。VP2是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，以前體的形式存在，在病毒顆粒成熟和釋放時，才能被蛋白水解酶進一步水解為成熟的VP2，并包裝于完整的病毒粒子中，IBDV非編碼區(qū)包括片段A的5′端約 134bp，3′端約 96bp，片段 B的 5′端約111bp，3′端約79bp。A和B兩個片段的非編碼區(qū)內(nèi)存在同向末端和反向重復(fù)互補序列，這種反向倒置重復(fù)序列可通過形成發(fā)夾式構(gòu)象對RNA起穩(wěn)定作用，是RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要信號。

1.2 病毒蛋白及其作用 VP1蛋白分子質(zhì)量約97KD，僅占總蛋白量的3%，位于核衣殼的內(nèi)面，是一種依賴RNA的RNA多聚酶，與病毒RNA復(fù)制有關(guān)[4]，VP1對IBDV衣殼的組裝是非必需的，但對基因組的復(fù)制卻是必要的，另外，VP1還具有鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，它通常以VPg和VP1兩種形式存在，VPg為一基因連接蛋白，把A、B兩個片段首尾相連，自由形式的VP1與病毒粒子的形成有關(guān)，因為VP1-VP3復(fù)合體的形成是IBDV病毒粒子形成的關(guān)鍵步驟[5]。VP2蛋白的分子質(zhì)量約37KD，占病毒總蛋白的51%。VP2有1個高變區(qū)，該區(qū)由151個氨基酸殘基組成，高變區(qū)與抗原和毒力的關(guān)系最為密切，在高變區(qū)內(nèi)含有3個重要的結(jié)構(gòu)，即 2個親水區(qū)和 1個七肽區(qū)。位于第212～224位 氨 基 酸 殘 基 間 的 第 一 親 水 區(qū)DYQFSSQYQPGG，對病毒構(gòu)象穩(wěn)定性起著重要作用，位于第314～324位氨基酸殘基間的第二親水區(qū)TSKSGGQAGDQ，是主要的宿主保護性抗原，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生病毒中和抗體，位于326～332位氨基酸殘基間的七肽區(qū)SWSASGS，對IBDV毒力的有決定性作用。因此，VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護性抗原，也是病毒衣殼的主要成分，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)與識別、病毒毒力變異、病毒的抗原漂移、細胞凋亡的誘導(dǎo)VP3蛋白分子質(zhì)量約33KD，占病毒總蛋白的43%，對IBDV衣殼的形成和形態(tài)的完整是必需的，VP3蛋白的末端有許多散在分布的脯氨酸，形成一個堿性區(qū)，可與核酸相互連接，從而具有穩(wěn)定病毒RNA的作用，此外，VP3的許多區(qū)段具有親水性，在促進病毒與抗體反應(yīng)時發(fā)揮作用。VP4蛋白分子質(zhì)量約為28KD，具有蛋白水解酶活性，其主要作用在于對多聚前體蛋白NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的加工，釋放出VP2和VP3兩個主要的結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明，VP4可在被感染的細胞的原生質(zhì)表面自聚為管狀結(jié)構(gòu)，可能起著絲氨酸蛋白酶的功能。VP5蛋白分子質(zhì)量約17KD，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒在體內(nèi)和體外復(fù)制都是非必須的。但在IBDV感染的細胞中有VP5蛋白，其功能尚不清楚。可能在病毒的病原性方面起重要的作用，缺少VP5蛋白，病毒的毒力弱化，但不會影響自然宿主對IBDV的外周體液免疫應(yīng)答[6]。

2 分子生物學(xué)診斷

2.1 常規(guī)PCR方法 PCR方法是根據(jù)目的片段設(shè)計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。蘇曉鷗等[7]根據(jù)IBDV VP2基因的高度保守序列，設(shè)計并合成了一對引物，建立了IBDV RT-PCR檢測方法，經(jīng)過優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，最終獲得預(yù)期453bp的目的片段，IBDV擴增產(chǎn)物經(jīng)測序結(jié)果證實與GenBank中已發(fā)表的致病力不同的IBDV毒株相應(yīng)序列同源性達97.4%-99.9%，最終建立了RT-PCR檢測方法。用已建立的RTPCR方法對已知的8份臨床IBDV陽性法氏囊病料進行檢測，陽性率達100%，另外對2份雞白血病病毒、2份雞傳染性喉氣管炎病毒、2份雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性病料進行平行同條件檢測，結(jié)果均為陰性。表明所建立的RT-PCR特異性好、敏感性高，可用于雞傳染性法氏囊病的臨床初步診斷及流行病學(xué)調(diào)查。孫潔等[8]采用世界動物衛(wèi)生組織推薦的帶有通用引物和酶切位點的特異性引物，通過對6株不同毒株的反復(fù)試驗，優(yōu)化了針對A片段VP2基因的常規(guī)RT-PCR檢測方法和針對B片段VP1基因的RT-PCR檢測方法，兩種RT-PCR檢測方法的靈敏度均為10-3，與其他家禽病毒無任何交叉反應(yīng)。

2.2 PCR-RFLP方法 PCR-RFLP方法通過設(shè)計保守引物，PCR擴增目的基因序列片段，然后用限制性內(nèi)切酶酶切，通過觀察其酶切片段差異即可鑒定不同種或不同基因型。楊蒙等[9]根據(jù)IBDV VP2基因的共保守序列設(shè)計 1對引物，分別以IBDV超強毒株GX8/99、陜西分離株、強毒株(XZ-1、ZZ-1、JL、GX-2、JS-2、SD-1、SD-3、HeN-4、ZJ-1、JX-2、JS-30)和疫苗株(B87、NF8)的VP2保守序列為模板，采用RT-PCR方法擴增VP2基因的共保守序列，并構(gòu)建IBDV不同毒株的重組質(zhì)粒。用AhaⅠ/StuⅠ和BamHⅠ/NspⅠ2組限制性內(nèi)切酶分別對超強毒株、強毒株及疫苗株的重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。結(jié)果顯示，擴增出了IBDV VP2基因中的共保守序列，其長度為802bp。超強毒株能被AhaⅠ/StuⅠ切出327bp的片段，而強毒株及疫苗株則能被BamHⅠ/NspⅠ切出270bp的片段。該RT-PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶切的鑒別方法能夠很好的區(qū)分IBDV超強毒株與強毒株和疫苗株。

2.3 熒光定量PCR方法 熒光定量PCR(QRTPCR)技術(shù)是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準確定量起始模板數(shù)。朱春華等[10]通過RT-PCR方法擴增IBDV的VP5基因保守片段，將其克隆到pMD18-T載體，經(jīng)測序鑒定得到陽性質(zhì)粒。以陽性質(zhì)粒為標準品，建立SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR的標準曲線和溶解曲線。結(jié)果表明，IBDV熒光定量PCR的標準曲線Ct值與3.29×10～3.29×108之間的病毒基因拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該方法靈敏度可達33拷貝，且特異性和重復(fù)性好。周欣等[11]根據(jù)IBDV VP4基因的保守序列設(shè)計并合成了一對引物，以所構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽性標準品，建立了檢測IBDV核酸載量的SYBR Green I qRT-PCR，結(jié)果表明，其Ct值與標準品模板在 4.03×101～109拷貝/μl范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，對IBDV核酸的最低檢出量為40拷貝/μl，靈敏度是常規(guī)RT-PCR檢測方法的 1000倍，該方法不與其它禽源病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)變異系數(shù)小于0.5%。何秀苗等[12]建立基于IBDV VP2基因的QRT-PCR技術(shù)和標準曲線，并檢測該QRT-PCR體系的特異性、靈敏度和重復(fù)性，最后將該QRT-PCR體系應(yīng)用于雞外周血淋巴細胞中vvIBDV復(fù)制規(guī)律以及臨床樣品的檢測。結(jié)果表明，建立的QRT-PCR體系特異性好，不能與NDV、IBV及FAV1等發(fā)生反應(yīng)，敏感度為1.51× 101拷貝數(shù)/μl，擴增效率達1.018，重復(fù)性試驗組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于0.5%，在vvIBDV感染后6h收獲的細胞含病毒基因組拷貝數(shù)最高，對IBD疑似病例的檢測敏感度高于套式RT-PCR技術(shù)。表明建立的反應(yīng)體系特異、靈敏度高，并具有很好的穩(wěn)定性，可應(yīng)用于病毒復(fù)制水平的檢測和臨床樣品的檢測。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是在等溫條件進行擴增反應(yīng)，基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，可在15～60min擴增109～1010倍。楊作豐等[13]設(shè)計了針對IBDV VP1基因保守區(qū)6個特異性部位的4條引物，建立了IBDV的LAMP檢測方法。該方法反應(yīng)體系在恒溫水浴鍋中作用1h即可得到其特有的階梯狀條帶，加入熒光素后肉眼可直接觀察結(jié)果。本方法特異性高，對IBDV的最低檢出量為10-6稀釋倍數(shù)，敏感性是普通RT-PCR的100倍。反轉(zhuǎn)錄LAMP檢測方法和普通RT-PCR方法檢測臨床樣品的符合率為93.8%。

3 基因工程疫苗

3.1 基因工程亞單位疫苗 利用 DNA重組技術(shù)，將外源基因?qū)胧荏w菌或細胞，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈，提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。Pitovsky等[14]將IBDV KS株VP2基因重組到桿狀病毒后，用重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞裂解物免疫SPF雞，結(jié)果顯示，重組桿狀病毒表達疫苗優(yōu)于法氏囊組織制備的疫苗。杜冬華等[15]將 IBDV HB株VP2基因亞克隆到原核表達載體pET-32ac(+)中并對其進行了誘導(dǎo)表達，重組蛋白純化后，免疫接種6周齡BALB/c小鼠，制備的血清ELISA效價在1:6400以上，說明所表達的HB株VP2蛋白免疫原性良好。 藍勝芝等[16]構(gòu)建了能表達IBDV VP2基因的重組酵母菌株，經(jīng)搖瓶誘導(dǎo)表達試驗獲得穩(wěn)定高效分泌表達的酵母工程菌，表達量為0.459mg/ml，聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡以及動物試驗表明，重組酵母工程菌表達的目的蛋白具有IBDV天然蛋白的生物活性和免疫原性。

3.2 核酸疫苗 核酸疫苗又稱為DNA疫苗，它是將外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)， 產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答反應(yīng)。Chang等[17]將IBDV VP0基因克隆到pCR311載體中，肌內(nèi)免疫證實，所產(chǎn)生的抗體水平與攻毒保護率隨著免疫次數(shù)的增加而提高，攻毒后不出現(xiàn)臨床癥狀。免疫2次以上時，攻毒后沒有出現(xiàn)法氏囊萎縮，法氏囊組織中也沒有檢測到IBDV。侯賢宏等[18]將2周齡SPF雞隨機分為6組，以200μg/羽劑量首免：A組免疫重組真核表達重組質(zhì)粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18，B組免疫 pCI-ChIL-18-VP2/4/3，C組免疫pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18，D組免疫 pCI-VP2/4/ 3，E組免疫pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3，F(xiàn)組為空白對照，2周后以相同劑量二免，通過攻毒保護試驗等，比較各試驗組IBDV DNA疫苗的免疫原性。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18的保護效果最好，保護率達93.3%，pCI-VP2/4/3-ChIL-18免疫效果次之，保護率達80.0%，pCIChIL-18-VP2/4/3與pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3的免疫效果無顯著差異，保護率均為73.3%，但均優(yōu)于單獨使用重組質(zhì)粒pCI-VP2/4/3組，保護率為60.0%。

3.3 活載體疫苗 活疫苗是將外源病原基因插入已有的病毒或細菌疫苗株基因組或其質(zhì)粒的某些部位使之高效表達，但不影響該疫苗株的生存與繁殖。接種后，除對原來的病原的保護之外，還獲得對插入基因相關(guān)疾病的保護力。Heine等[19]以TK基因作為同源序列，在痘苗病毒晚期啟動子及雞痘病毒的pEPL啟動子下分別表達IBDVVP2和VP0基因，將重組雞痘病毒翼下刺種，都能產(chǎn)生抗FPV抗體，但只有含VP2基因的重組病毒才能誘導(dǎo)抗IBDV抗體，并具有明顯的保護力，但不能抵抗IBDV對法氏囊組織的損傷。李奇蒙等[20]以火雞皰疹病毒為載體，構(gòu)建了能表達IBDV VP2基因的重組病毒rHVT-VP2。將重組病毒在CEF細胞中連續(xù)傳代 20次，每隔 5代采用 PCR、western blot和間接免疫熒光進行檢測，結(jié)果表明VP2蛋白均得到穩(wěn)定地表達，為進一步研究其免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。 林紅麗等[21]構(gòu)建了能表達IBDVVP2基因的重組干酪乳桿菌，分別口服、滴鼻/點眼pLA-VP2/L.casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS為對照，監(jiān)測IgG和sIgA抗體水平，末免后7d檢測脾淋巴細胞增殖情況并攻毒，7d后剖檢，觀察法氏囊損傷程度并記錄病變得分和保護率。結(jié)果表明各組的特異性 sIgA、IgG抗體水平顯著高于對照組(P＜0.01)，口服pLAVP2/L.casei組的淋巴細胞刺激指數(shù)顯著高于其他組(P＜0.01)，保護率高達 83.3%，免疫保護效果優(yōu)于滴鼻/點眼組。

3.4 基因缺失/標記疫苗 基因缺失疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒致病性基因進行缺失，從而獲得弱毒活疫苗，該類疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答很容易與自然感染的抗體反應(yīng)區(qū)別開來，故又稱為 “標記”疫苗，它有利于疫病的控制和消滅計劃。高立等[22]為評價IBDV VP5缺失病毒株rHLJ0504HT△VP5的生物學(xué)特性，對該缺失病毒與其親本病毒rHLJ0504HT(vvIBDV HLJ0504 253/284雙位點突變細胞適應(yīng)病毒)進行了體外復(fù)制動力學(xué)比較研究。結(jié)果表明，VP5缺失病毒復(fù)制滴度明顯低于親本病毒(P＜0.05)。動物實驗結(jié)果表明，該缺失病毒可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫后10d，其抗體水平與親本病毒相當，并能夠抵抗同源或異源超強毒的攻擊，為免疫雞提供100%保護。此外，該缺失病毒對免疫雞無明顯的致病性，VP5缺失病毒免疫組與未免疫組禽流感血凝抑制效價相當，不存在明顯差異(P＞0.05)，表明該病毒對免疫雞無免疫抑制作用，不影響其它疫苗的免疫效果。而且，VP5的缺失可以作為鑒定該缺失病毒的生物學(xué)標記。

3.5 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒又稱偽病毒或假病毒，是由病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白自動組裝而成的空心顆粒，外形與天然病毒粒子相似，不含病毒核酸，不能復(fù)制，具有很強的免疫原性，可作為免疫原，安全性好，無感染性，能誘導(dǎo)機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)，是研制安全高效的預(yù)防病毒病的潛在候選疫苗。Lee等[23]用桿狀病毒表達的VP2蛋白可以自發(fā)形成直徑23nmVLP，經(jīng)過硫酸銨鹽析、親和層析等方法獲得結(jié)晶體。李芹等[24]構(gòu)建了含vvIBDV JL株的VP2全長基因的重組桿粒rBacmid-VP2，將重組桿粒rBacmid-VP2轉(zhuǎn)染sf9細胞后得到重組桿狀病毒vBac-VP2，將該重組病毒感染sf9細胞，提取DNA，經(jīng)PCR電泳分析，得到1條與預(yù)期大小相符的特異性條帶，間接免疫熒光檢測，可見特異性熒光，Westernblotting分析，在大約53KD處出現(xiàn)1條特異性的蛋白條帶，電鏡觀察感染重組桿狀病毒的細胞上清和沉淀，均可見重組VP2蛋白自行組裝形成的病毒樣顆粒。

4 展望

IBD是雞的一種非常重要免疫抑制性疾病，廣泛存在于世界各地，給世界養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因此，做好IBD防控的研究相關(guān)工作非常重要。目前已經(jīng)建立了多種IBDV分子生物檢測方法，如常規(guī)PCR方法、PCR-RFLP方法、熒光定量PCR方法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等，但這些方法各有利弊，有時需將幾種檢測方法結(jié)合起來，綜合判斷，才能得到準確的檢測結(jié)果。目前對于IBD主要依靠疫苗接種來預(yù)防。傳統(tǒng)IBD弱毒活疫苗存在隱性帶毒和變異等風(fēng)險，且現(xiàn)有的診斷方法無法區(qū)分自然感染野毒和弱毒疫苗免疫的動物。而IBD滅活疫苗產(chǎn)生的免疫維持期短，并且需要大劑量免疫，成本高。傳統(tǒng)的IBD疫苗不能對IBDV新出現(xiàn)的變異毒株和超強毒株提供有效的保護，因此，開發(fā)安全有效的基因工程疫苗是IBD疫苗研發(fā)的重要方向，國內(nèi)外學(xué)者研制了大量的IBD基因工程疫苗，取得了一定的成績，但綜合安全性、效力等多方面評價，大多數(shù)疫苗的研發(fā)僅停留在試驗室階段，并沒有大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，目前已經(jīng)有國內(nèi)公司生產(chǎn)的商品化的大腸桿菌表達的基因工程亞單位疫苗投放市場，并且據(jù)說市場反應(yīng)不錯，本人以為該產(chǎn)品畢竟屬于大腸桿菌表達，如果內(nèi)毒素去除不完全，則會有一定的安全隱患，但若徹底去除內(nèi)毒素可導(dǎo)致生產(chǎn)成本能較高，對于該疫苗效果筆者以為還有待于市場的進一步驗證，因此，篩選出典型毒株研發(fā)高效、安全、價廉的IBD基因工程疫苗是今后努力的方向?，F(xiàn)用的傳統(tǒng)IBD疫苗不會退出市場，短期內(nèi)新型疫苗可能還不會完全替代現(xiàn)行的傳統(tǒng)疫苗，相信隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，在不遠的將來，IBD基因工程亞單位疫苗必定會全面取代IBD傳統(tǒng)疫苗。

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學(xué)第二版.[M].北京：科學(xué)出版社，1997，582-586.

[2] 韋平.家禽病毒性免疫抑制病的危害及其防制策略[J].中國家禽，2001，23(22)：182-185.

[3] Müller H，Islam MR，Raue R.Research on infectious bursal disease-the past，the present and the future [J].Vet Microbiol，2003，97(1-2)：153-165.

[4] MüllerH,Scholtissek C,BechtH.The genome ofinfectious bursaldisease virus consists oftwo segments of double-stranded RNA[J].Virol.1979，31 (3)∶584-589.

[5] 胡曉苗，汪麗，張丹俊，傳染性法氏囊病病毒分子生物學(xué)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2006，27(12)∶10-14.

[6] 包曉瑋，張厚雙，高宏雷，等.雞傳染性法氏囊病超強毒 Gx及其致弱株基因組 B節(jié)段的克隆和序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2005，27(2)：85-89.

[7] 蘇曉鷗，趙德明.雞傳染性法氏囊病病毒 RT-PCR檢測方法的建立 [J].動物醫(yī)學(xué)進展，2008，29(09)：5-8.

[8] 孫潔，盧體康，曾少靈，等.雞傳染性法氏囊病病毒RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用 [J].動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34(12)：6-10.

[9] 楊蒙，張彥明，趙路易.IBDV超強毒株、強毒株及疫苗株的快速鑒別診斷 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，36(03)：44-48.

[10] 朱春華，林甦，程龍飛，等.雞傳染性法氏囊病病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26(02)：175-179.

[11] 周欣，楊霞，趙軍，等.雞傳染性法氏囊病毒實時qRT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].病毒學(xué)報，2012，28(04)：424-430.

[12] 何秀苗，甘珊珊，熊忠賢，等.IBDV熒光定量 RTPCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，26(02)：798-802.

[13] 楊作豐，石霖，鄧文超，等.雞傳染性法氏囊病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)媒恒溫檢測方法的初步建立[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014，12：12-17.

[14] Pitcovski J，Di-Castro D，Shaltiel Y，et al.Insect cell-derived VP2 of infectious bursal disease virus confers protection againstthe disease in chickens[J].Avian Dis，1996，40(4)：753-761.

[15] 杜冬華，周靜，王愛華，等.傳染性法氏囊病病毒HB株 VP2蛋白的表達及免疫原性測定[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34(02)：71-74.

[16] 藍勝芝，徐素珍，李寶臣，等.傳染性法氏囊病毒免疫原基因在畢赤酵母中的高效分泌表達[J].中國動物檢疫，2013，09：50-55.

[17] Chang HC，Lin TL，Wu CC.DNA-mediated vaccination against infectious bursal disease in chickens [J].Vaccine，2001，20 (3-4)：328-335.

[18] 侯賢宏，魏永偉，章曉棟，等.IBDV VP2/4/3與ChIL-18融合基因真核表達質(zhì)粒和基因共表達質(zhì)粒的免疫原性比較[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(10)：785-789.

[19] Heine HG，Boyle DB.Infectious bursal disease virus structural proteinVP2 expressed by a fowlpox virus recombinant confers protection againstdisease in chickens[J].Arch Virol，1993，131(3-4)：277-292.

[20] 李奇蒙，陳普成，柳金雄，等.表達傳染性法氏囊病毒 VP2蛋白的重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36(07)：515-518.

[21] 林紅麗，侯申達，王嵩，等.表達雞傳染性法氏囊病毒 VP2蛋白的干酪乳桿菌免疫保護效力[J].生物工程學(xué)報，2014，30(11)：1679-1690.

[22] 高立，李凱，祁小樂，等.雞傳染性法氏囊病病毒VP5缺失標記疫苗的生物學(xué)特性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36(08)：659-662.

[23] Lee CC，Ko TP，Lee MS，et al.Purification，crystal lization and prelimi-nary X-ray analysis of immunogenic virus-like particles formed by infec-tious bursaldisease virus(IBDV)structural protein VP2 [J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2003，59(7)：1234-1237.

[24] 李芹，王建忠，黃楚荻，等.雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒的制備[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2014，34(11)：1725-1731. □

《中國商品代育成雞行業(yè)標準》出爐

近日，由中國吉蛋堂主辦的中國第二屆育成雞行業(yè)發(fā)展與趨勢高峰論壇在鄭州召開。據(jù)悉，來自全國11個省市的41家優(yōu)秀育成企業(yè)家代表齊聚，共同探討行業(yè)未來方向。此外，現(xiàn)場還審定通過了《中國商品代育成雞標準》，此標準出臺將推動蛋雞行業(yè)健康發(fā)展，促使農(nóng)牧行業(yè)向規(guī)范化、專業(yè)化、國際化轉(zhuǎn)型。

蛋雞行業(yè)要開放包容地整合資源。如今，互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)業(yè)越來越多地影響到傳統(tǒng)行業(yè)，作為相對邊緣化的養(yǎng)殖業(yè)，也需要抱團取暖、合作共贏。對此，中國吉蛋堂創(chuàng)始人張達認為，蛋雞行業(yè)的企業(yè)更需要建立一個全國性的生態(tài)圈，讓蛋雞產(chǎn)業(yè)鏈精英可以在這個平臺上進行交易、交流和溝通?！按舜挝覀儾粌H集合蛋雞行業(yè)的企業(yè)，還有上下游企業(yè)，就是希望大家可以共商業(yè)內(nèi)大事、共享資源?！睆堖_說，當今時代你整合了好多人，說明你有能力，如果你被別人整合，說明你有價值。因此，他希望蛋雞行業(yè)也要以更加開放包容的心態(tài)去發(fā)展、去整合資源。對此，前來參會的代表們紛紛表示建立一個生態(tài)社群順應(yīng)時代潮流，也順應(yīng)發(fā)展趨勢。“一直覺得養(yǎng)殖業(yè)比較邊緣化，也屬于自己埋頭苦干的行業(yè)，很少溝通和交流，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這樣不對，而是應(yīng)該多跟業(yè)內(nèi)人士學(xué)習(xí)，這樣對蛋禽業(yè)的未來發(fā)展，更加充滿了信心?！睆纳轿髭s來的企業(yè)家代表聶武斌說。

審定通過《中國商品代育成雞行業(yè)標準》。此外，近年來，隨著蛋雞產(chǎn)業(yè)標準化、規(guī)?；难该桶l(fā)展，推動了行業(yè)的專業(yè)化分工，催生出一批專業(yè)的育成雞生產(chǎn)和銷售隊伍。但由于育成雞行業(yè)發(fā)展時間較短，育成廠家增加很多，雖然發(fā)展速度過快，但參差不齊，大多不規(guī)范。比如：育成雞的價格差異很大,從11～19元不等;此外，出售日齡不一、防疫結(jié)果不一，沒有明顯的質(zhì)量概念，加之下游用戶對育成雞沒有基礎(chǔ)認識和一致的驗收標準，致使行業(yè)出現(xiàn)信任問題、滯銷問題等。

同時，育成雞行業(yè)沒有行規(guī)，沒有國標，很多企業(yè)不按規(guī)矩出牌，最終損傷了行業(yè)利益和下游養(yǎng)殖戶的利益。因此，為滿足蛋雞品種不斷更新的要求，延長產(chǎn)蛋周期和提高養(yǎng)殖綜合效益，為促進資源有效利用，提高勞動效率，推動行業(yè)的專業(yè)化、規(guī)范化進程，帶動蛋雞行業(yè)健康發(fā)展，由中國吉蛋堂提出并起草的《中國商品代育成雞行業(yè)標準》，也在此次會議上供業(yè)內(nèi)專業(yè)人士討論、審定，并最終通過。

據(jù)悉，該標準的主要內(nèi)容應(yīng)包括育成雞出售基本標準和服務(wù)事項，適應(yīng)于育成雞生產(chǎn)、銷售的企業(yè)與個人。

S858.315.3

A

1673-1085（2016）2-0016-06

2016-01-19

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊生產(chǎn)與環(huán)境控制創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-13-011-10)；山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF121027)。

于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷及防控研究。