唐季云 （江蘇省南通市通州區(qū)林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站 226300）李 敏 王 瑩 張 健 （江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇省南通市 226541）

林木轉(zhuǎn)抗蟲基因育種研究綜述

唐季云 （江蘇省南通市通州區(qū)林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站 226300）李 敏 王 瑩 張 健 （江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇省南通市 226541）

林木轉(zhuǎn)抗蟲基因分子育種技術(shù)是利用DNA重組技術(shù)，將天然或構(gòu)建的外源抗性基因?qū)肓帜救旧w，從而產(chǎn)生具有外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因林木。為促進(jìn)林木轉(zhuǎn)抗蟲基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對國內(nèi)外林木抗蟲基因工程現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對其研究發(fā)展中存在的問題進(jìn)行了探討，以供參考。

林木；轉(zhuǎn)抗蟲基因；分子育種技術(shù)

林木轉(zhuǎn)抗蟲基因分子育種技術(shù)是利用DNA重組技術(shù)，將天然或構(gòu)建的外源抗性基因?qū)肓帜救旧w中，從而產(chǎn)生具有外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因林木[1]。自20世紀(jì)80年代以來，由于生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，隨著各種抗蟲基因的發(fā)現(xiàn)和克隆以及抗蟲基因在高等植物細(xì)胞中的表達(dá)等方面的深入研究，加速了林木轉(zhuǎn)抗蟲基因工程技術(shù)的發(fā)展，為林木抗蟲育種開辟了一條全新的、突破性的途徑。目前，已對楊樹、火炬松、核桃、刺槐、楓香、桉樹、歐洲黑楊等樹種進(jìn)行了抗蟲分子育種方面的研究，其中，部分樹種已獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，并建成了相關(guān)品系，且已在生產(chǎn)上進(jìn)行了應(yīng)用[2]。為促進(jìn)林木轉(zhuǎn)抗蟲基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，筆者對國內(nèi)外林木抗蟲基因工程現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對其研究發(fā)展中存在的問題進(jìn)行了探討，以供參考。

1 抗蟲基因的研究概況

林木轉(zhuǎn)抗蟲基因育種的關(guān)鍵是獲得有用的抗蟲基因，目前，人們已從細(xì)菌、植物本身及昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離出了許多抗蟲基因，且有的已導(dǎo)入植物并獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。目前，抗蟲基因的主要來源有三類:第一類是從微生物中分離出來，其抗蟲基因主要是蘇云金桿菌毒蛋白基因；第二類是從植物組織中分離出來，其抗蟲基因主要為蛋白酶抑制劑基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制劑基因等；第三類是從動物體內(nèi)分離的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。

1.1 微生物中來源的抗蟲基因

主要為蘇云金桿菌毒蛋白基因。蘇云金桿菌（Bacillus thuringicnsis，Bt），為革蘭氏陽性菌，屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，是一種具有特異性殺蟲活性的蛋白質(zhì)[3]。1989年，Hofte和whitely將當(dāng)時已報道的42個Bt毒蛋白基因，根據(jù)毒蛋白基因的核苷酸序列同源性和抗蟲譜的差異性分為4大類和14個亞類，其中CryⅠ對鱗翅目、CryⅡ?qū)[翅目和雙翅目、CryⅢ對鞘翅目、CryⅣ對雙翅目有特異毒性[4]。隨著新分離的和人工合成的Bt毒蛋白基因數(shù)量的持續(xù)增多，根據(jù)其同源性將它們分為64大類、116個亞類，抗蟲范圍也得到了不斷地擴(kuò)大。

1987年，比利時Mentagn實驗室的Veack等[5]首次報道獲得了抗蟲基因植株，該植株是用CryⅠA[b]基因與NPTⅡ基因融合，轉(zhuǎn)入煙草后得到轉(zhuǎn)基因煙草植株，在實驗室條件下，用煙草天蛾幼蟲檢測抗蟲性，結(jié)果證明其有一定的抗蟲效果。1990年，伍寧豐等[6]成功將對鱗翅目昆蟲有毒性的Bt毒蛋白基因?qū)霘W洲黑楊并獲得轉(zhuǎn)基因植株。同年，中科院上海植生所和南京林業(yè)大學(xué)合作，將Bt基因?qū)朊讞詈碗s種楊[7]。1991年，McCown等[8]利用電擊法將抗蟲基因（Bt）導(dǎo)入雜種楊（Populus alba L×P.grandidentata 和 Populus nigra L.×P.trichocarpa），并獲得了抗舞毒蛾和天幕毛蟲的轉(zhuǎn)基因植株。1993年，田穎川等用帶有35S-Ω-Bt-NOS雙元載體的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化歐洲黑楊獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)抗蟲測定證實，楊尺蠖和舞毒蛾的死亡率達(dá)80%～100%，并對害蟲的生長和發(fā)育有明顯的抑制作用。1994年，KLeiner等獲得抗枯葉蛾毛蟲和吉普賽蛾的轉(zhuǎn)基因雜種楊NC5339。同年，Shin等將Bt基因轉(zhuǎn)入歐洲落葉松并檢測到該基因的表達(dá)。Pilaee于1995年將切割蛋白酶基因轉(zhuǎn)入楊樹，轉(zhuǎn)化植株的食葉昆蟲死亡率達(dá)40%。同年，美國威斯康星、麥迪頓大學(xué)等成功地將抗蟲Bt基因與蛋白酶抑制劑基因?qū)氚自粕?，有效防止了卷葉蛾的危害。1995年，鄭均寶等[9]用含有完全改造的Bt基因表達(dá)載體PB 48.7和部分改造Bt基因表達(dá)載體PB 48.7轉(zhuǎn)化白楊741雄株，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。中國林科院和北京大學(xué)于1996年合作開展了抗蛀干害蟲天牛的轉(zhuǎn)基因研究[10]。1996年，Wang等也成功獲得轉(zhuǎn)Bt基因的歐洲黑楊植株，經(jīng)2～3年的抗蟲測定和優(yōu)良性狀選擇，已有3個無性系(12、153、192)在中國6個省進(jìn)行種植評估。Dandekar等(1998)在核桃上也獲得了轉(zhuǎn)crylA基因的抗蟲植株。1999年，郝貴霞等成功將廣譜抗蟲基因豌豆胰蛋白酶抑制劑（CPTI）基因?qū)朊讞?，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。2000年，伍寧豐等[11]將特異毒殺鱗翅耳昆蟲的神經(jīng)毒素AalT基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入南方楊樹N-106中，獲得62株再生植株，經(jīng)Southern雜交檢測，目的基因成功整合到了基因組中，殺蟲試驗證實轉(zhuǎn)基因楊樹對一齡期舞毒蛾生長有明顯的抑制作用。2004年，姜靜等[12]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將Bt基因C肽序列和蜘蛛殺蟲肽組成的融合基因?qū)胄『跅?，抗蟲試驗表明，轉(zhuǎn)基因株系具有明顯的抗蟲效果。綜上截至目前，已知的表達(dá)Bt基因的樹種有楊樹、樺樹、蘋果、核桃、落葉松、花旗松、火炬松和云杉等。

1.2 植物來源的抗蟲基因

1.2.1 蛋白酶抑制劑基因

天然的蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor，PI)廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，可使害蟲消化不良，延長其發(fā)育時間，減少每年的繁殖代數(shù)，降低害蟲的種群數(shù)量[13]。其作用機(jī)理是與昆蟲腸內(nèi)蛋白酶或病原微生物蛋白酶形成酶抑制劑復(fù)合物(EI)，阻斷或減弱消化酶的蛋白水解作用，同時刺激昆蟲消化酶的過量分泌，通過神經(jīng)系統(tǒng)反饋，使其產(chǎn)生厭食反應(yīng)，最終導(dǎo)致昆蟲消化不良而影響正常發(fā)育，甚至死亡[14]。目前，在植物中發(fā)現(xiàn)有3類PI，分別是絲氨酸PI、巰基PI和金屬PI，并已分離出多種蛋白酶抑制劑基因或cDNA克隆。其中最引人矚目的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因和水稻巰基蛋白酶抑制劑基因。1987年，Hilder[15]首次將CPTI基因成功轉(zhuǎn)入煙草獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因的煙草對煙芽夜蛾、米穗蛾、棉鈴蟲和粘蟲等具有毒殺和抑制生長的作用。Mcnabb等[16]首次將馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因（pin ll）導(dǎo)入楊樹NC5399無性系。Klopfenstein等[17]將pin ll基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入雜交楊（銀白楊×大齒楊），ELISA和Western Blot檢測表明，轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)了PIN ll蛋白，并能明顯抑制幼蟲的生長。近年來，國內(nèi)外學(xué)者還相繼把CPTI基因轉(zhuǎn)入一些重要的經(jīng)濟(jì)植物中，如水稻、油菜、白薯、楊樹和蘋果等。

1.2.2 植物凝集素基因

植物凝集素（lectin）是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，它們能聚集細(xì)胞和沉淀糖蛋白[18]。其抗蟲機(jī)理是當(dāng)其被昆蟲取食后，外源凝集素在昆蟲的消化道中與腸道圍食膜上的糖蛋白相結(jié)合或與消化道上皮細(xì)胞的糖綴合物相結(jié)合，從而影響營養(yǎng)的吸收。同時，外源凝集素還可能在昆蟲的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進(jìn)消化道內(nèi)細(xì)菌繁殖，對害蟲本身造成危害，抑制害蟲生長發(fā)育繁殖，從而達(dá)到殺蟲的目的[19]。

目前成功用于植物抗病蟲害基因工程的植物凝集素基因主要有雪花蓮凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、麥胚凝集素基因、莧菜凝集素基因及核糖體失活蛋白基因等[20]。英國劍橋農(nóng)業(yè)遺傳公司和Durham大學(xué)把分離出的雪花蓮凝集素基因成功地導(dǎo)入煙草，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲表現(xiàn)出了明顯抗性。Boulter等[21]在獲得能穩(wěn)定表達(dá)外源豌豆凝集素基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株之后，進(jìn)一步和轉(zhuǎn)基因cpti植株雜交，篩選出既能表達(dá)豌豆凝集素又能表達(dá)CPTⅠ的雙價轉(zhuǎn)基因煙草，其抗蟲能力顯著提高，這也表明基因間的協(xié)同作用有可能大大提高作物抗性。目前報道的轉(zhuǎn)植物凝集素基因的植物有水稻、煙草、馬鈴薯、小麥、番茄等，均表現(xiàn)出對桃蚜、水稻褐飛虱、菜園夜蛾和麥長管蚜等害蟲的抑制和抗性[22]。

1.2.3 淀粉酶抑制劑基因

淀粉酶抑制劑(α-Amylase Inhibitor，α-AI)是一種熱穩(wěn)定的糖蛋白質(zhì)，它能抑制哺乳動物及昆蟲體內(nèi)的α-淀粉酶的活性，從而阻斷對攝取食物中淀粉成分的消化[23]。淀粉酶抑制劑在植物界中普遍存在，尤其是在禾谷類作物和豆科作物的種子中，含量更為豐富。其抗蟲機(jī)理與蛋白酶抑制劑相似，對昆蟲消化道內(nèi)α-淀粉酶的活性有抑制作用，通過使攝入的淀粉無法正常消化水解，阻斷其主要能量來源。同時，α-AI和淀粉消化酶結(jié)合形成的復(fù)合物也會刺激昆蟲的消化腺過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)，最后導(dǎo)致非正常發(fā)育或死亡[24]。

α-AI是一種天然的抗蟲蛋白，對某些害蟲的α-淀粉酶具有抑制作用，將它用于轉(zhuǎn)基因抗蟲，安全性好，易于為公眾接受。用轉(zhuǎn)小麥α-AI基因的煙草葉片喂養(yǎng)鱗翅目幼蟲，其死亡率增加30%～40%。目前，已從小麥和大麥中克隆出該基因轉(zhuǎn)化到煙草中，且能在煙草植株中準(zhǔn)確、穩(wěn)定地表達(dá)，并在煙草種子發(fā)育過程中積累[25]。

1.3 動物來源的抗蟲基因

此類是從動物體內(nèi)分離的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。如蝎子、蜘蛛、胡蜂、螞蟻等產(chǎn)生的毒素，能使害蟲神經(jīng)麻痹，使其失去知覺不能正常取食而死亡；同時，蝎子和蜘蛛產(chǎn)生的毒素一般只能專一性作用于昆蟲，而對哺乳動物無害或毒性很小[26]。其抗蟲原理是將昆蟲激素基因轉(zhuǎn)入植物后可擾亂害蟲體內(nèi)激素平衡，干擾昆蟲交配、棲息習(xí)慣或影響發(fā)育，從而達(dá)到控制蟲害的目的[27]。

胡延章等[28]利用東亞鉗蝎軟癱型昆蟲毒素基因（BmKlT4）獲得了抗煙草天蛾、棉鈴蟲和大豆食心蟲的煙草植株，且抗蟲植株自交后代仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲性。伍寧豐等將昆蟲特異性神經(jīng)蝎毒素（aait）基因轉(zhuǎn)入南方楊樹N-106中，獲得了再生植株，喂蟲實驗表明，轉(zhuǎn)基因植株能明顯抑制一齡舞毒蛾幼蟲的生長。

2 林木轉(zhuǎn)抗蟲基因育種中存在的問題與前景展望

2.1 林木抗蟲分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究薄弱

林木抗蟲分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究還很薄弱，總體上不如農(nóng)作物抗蟲害研究深入。但近幾年，國外做了相關(guān)研究并取得了一定成績，在此基礎(chǔ)上，我國克隆出了抗蟲性基因或改造的抗蟲性基因，這對我國林木抗蟲分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究起到了良好的推動作用。

2.2 轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率低且表達(dá)水平不高

由于轉(zhuǎn)基因的效率受許多因素的影響，當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入時，可能會引起宿主染色體的插入突變；同時，大多數(shù)林木還未建立有效的組培再生和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，能獲得轉(zhuǎn)基因植株的樹種極少，目前多數(shù)研究是圍繞楊樹開展的；此外，在有些轉(zhuǎn)基因林木中，還存在轉(zhuǎn)基因不表達(dá)或在不同林木中表達(dá)強(qiáng)度不一等問題。

2.3 昆蟲對Bt殺蟲晶體蛋白會產(chǎn)生抗性

與化學(xué)殺蟲劑相比，雖然昆蟲對Bt殺蟲劑產(chǎn)生的抗性發(fā)展緩慢，但已有相關(guān)資料證明，在Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因植株在選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性，這是林木抗蟲基因工程研究中存在的較為嚴(yán)重問題。要解決該問題，需要采取組合2個或2個以上的非競爭性Bt殺蟲晶體蛋白基因，同時或分別導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)，或?qū)⒉煌瑲⑾x機(jī)理的基因組合轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。

2.4 轉(zhuǎn)基因的抗性表達(dá)往往不理想

林木的抗蟲遺傳機(jī)理多數(shù)屬于多基因控制，這給樹木基因工程帶來了難度，其轉(zhuǎn)基因的抗性表達(dá)往往不理想。因此，如何在多基因中尋找到關(guān)鍵基因顯得尤為重要，此外，還可從寄主以外的材料中找到抗性基因。

2.5 抗蟲機(jī)理不清楚

目前，林木轉(zhuǎn)抗蟲基因雖對抗蟲性檢測進(jìn)行了大量分子及大田試驗研究，但其抗蟲機(jī)理還不十分清楚。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)這方面的深入研究，以利于培育抗性持久的林木，為林木生產(chǎn)減少損失，提高生態(tài)效益。此外，還應(yīng)不斷利用更新、更強(qiáng)和更專一的啟動子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并努力解決環(huán)境因素和植物體自身活動對外源基因表達(dá)的影響，克服傳統(tǒng)標(biāo)記基因的局限性?？梢灶A(yù)計，將來最有前景的工作就是外源基因精確定位到植物體，使林木在不同的生長時期、不同的部位對相應(yīng)害蟲表達(dá)足夠的抗性。

3 結(jié) 論

林木生長周期長，用常規(guī)育種方法不僅時間長、見效慢，而且可操作性差，而基因工程為林木抗蟲育種開辟了一條新途徑，應(yīng)用基因工程進(jìn)行林木抗蟲育種有其顯著的優(yōu)越性，不僅可大大縮短育種周期，還可在基因水平上改造林木抗性遺傳物質(zhì)，更具科學(xué)性和精確性，提高了育種的目的性和可操作性，擴(kuò)大了育種范圍，打破物種之間的生殖障礙，實現(xiàn)基因的共通性。因此，今后應(yīng)加大對林木轉(zhuǎn)抗蟲基因的研究投入，并有效地與常規(guī)的林業(yè)技術(shù)措施相配合，從而培育出更多有價值的抗蟲基因工程林木。

[1] 張立欽,董林根,方志剛.林木抗病蟲基因工程的現(xiàn)狀和問題[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(4):67-71.

[2] 李美娥,陳良昌.林木抗蟲、抗病分子育種研究進(jìn)展[J].湖南林業(yè)科技,2011,28(2):26-28.

[3] 崔洪志,郭三堆.Bt毒蛋白抗蟲植物基因工程研究(綜述)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,1998,6(2):166-172．

[4] Crickmore N,Zeigler D R,Feitelson J,et al.Revision of nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998,62(3):807-813．

[5] Vaeck M,Reynaerts A,Hofte H, et al.Trangsgenic plants protected from insect attack[J].Nature,1987,328(6125): 33-37.

[6] 伍寧豐,范云六.含蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因的楊樹工程植株的建立[J].科學(xué)通報,1991,36(9):705-708.

[7] McCown B H,McCabe D E,Russell D K, et al. Stable transformation of Populus and incorporation of pest resistance by electric discharge particle acceleration[J]. Plant Cell Reports, 1991,9(10):590-594.

[8] 李明亮,張輝,胡建軍,等.轉(zhuǎn)Bt基因和蛋白酶抑制劑基因楊樹抗蟲性的研究[J].林業(yè)科學(xué),2000,36(2):93-97.

[9] 鄭均寶,張玉滿,楊文芝,等.741楊離體葉片再生及抗蟲基因轉(zhuǎn)化[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1995(3):20-25.

[10] 田穎川,鄭均寶,虞紅梅,等.轉(zhuǎn)雙抗蟲基因雜種741毛白楊的研究(英)[J].植物學(xué)報,2000,42(3):263-268.

[11] 伍寧豐,孫芹,姚斌,等.抗蟲的轉(zhuǎn)AaIT基因楊樹的獲得[J].生物工程學(xué)報,2000,16(2):129-133.

[12] 姜靜,常玉廣,董京祥,等.小黑楊轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因的研究[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(6):669-672.

[13] 饒紅宇,黃敏仁.楊樹基因工程研究的現(xiàn)狀及展望[J].林業(yè)科技開發(fā),1999(4):3-6.

[14] 朱新生,朱玉賢.抗蟲植物基因工程研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報, 1997,39(3):282-288.

[15] Hilder V A, Gatehouse A M R, Sheerman S E, et al. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco[J].Nature,1987,330(6144):160-163.

[16] 張綺紋,蘇曉華.楊樹定向遺傳改良及高新技術(shù)育種[M].北京:中國林業(yè)出版社,1999.

[17] Leple J C,AC Brasileiro,MF Michel, et al. Transgenic poplars: expression of chimeric genes using four different constructs[J].Plant Cell Report,1995,11(3):137-141.

[18] 舒曉燕,阮期平,侯大斌.植物凝集素的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2006,20(6):53-56.

[19] 董朝蓬,杜林方,段真.植物凝集素研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(1):71-76.

[20] 潘科,黃炳球,侯學(xué)文.植物凝集素在病蟲害防治中的研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2002,28(4):42-44.

[21] 王志斌,張秀梅,郭三堆.在轉(zhuǎn)基因植物中利用植物凝集素防治害蟲的研究[J].植物學(xué)通報,2000,17(2):108-113.

[22] Boulter D, Edwards G A, Gatehouse A M R, et al. Additive protective effects of different plant derived insect resistance genes in transgenic tobacco plants[J]. Crop Prot,1990,9(5):351-354.

[23] 蘇賢坤,汪自強(qiáng),張曉海,等.煙草抗蟲基因工程研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,27(2):167-171.

[24] 赫衛(wèi)清,番一廷,唐益雄.淀粉酶抑制劑與抗蟲的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2002,22(2):172-174．

[25] 阮文麗,吳會會,劉樂承.植物抗蟲轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版:農(nóng)學(xué)卷),2012,9(10):23-26.

[26] 李文蘭.植物抗蟲基因工程的應(yīng)用與展望[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2004,35(3):245-248.

[27] 路志芳,張坤朋.植物抗蟲基因工程的研究進(jìn)展[J].上海蔬菜, 2006,(5):75-77.

[28] 胡廷章,徐云劍,江國英,等.轉(zhuǎn)BmKIT4基因煙草的抗蟲性[J].植物學(xué)報,2000,42(7):732-735.

2016-05-13

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目[編號：CX(14) 5094]；江蘇省“333工程”科研項目(編號：BRA2015125)，江蘇省“六大人才高峰”項目(編號：NY-042)。