賓 彬，陸海旺，王 杰，王德勝，徐杰新，覃智標(biāo)，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

強(qiáng)精煎對奧硝唑所致少弱精子癥大鼠抗氧化作用實(shí)驗(yàn)研究*

賓 彬，陸海旺△，王 杰，王德勝，徐杰新，覃智標(biāo)，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

目的:觀察強(qiáng)精煎對奧硝唑(ORN)誘導(dǎo)的少弱精子癥大鼠附睪精子氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方法:60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，模型組給予ORN，黃精贊育膠囊組給予ORN+黃精贊育膠囊，強(qiáng)精煎組給予ORN+強(qiáng)精煎，空白組給予生理鹽水。測定大鼠附睪精子的濃度、活動率、附睪丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活力以及睪丸附睪超微病理。結(jié)果:與空白組比較，模型組精子濃度及活動率、附睪SOD、GSH-Px活力明顯降低，MDA濃度及NOS活力顯著升高;與模型組比較，強(qiáng)精煎組及黃精贊育膠囊組精子濃度及活動率、SOD及GSH-Px活力升高，MDA、NOS活力降低。模型組生精上皮破損顯著、紊亂，精子產(chǎn)量銳減，強(qiáng)精煎組及黃精贊育膠囊組生精上皮受損輕、生精產(chǎn)量接近空白組。結(jié)論:強(qiáng)精煎可增強(qiáng)抗氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激對生精功能和精子活力的不良影響。

抗氧化作用;ROS;少、弱精子癥;健脾益腎法;強(qiáng)精煎

活性氧在精子運(yùn)動及其獲能中起重要作用，適量的活性氧可保護(hù)精子活力，反之過高的活性氧則造成精子膜的損傷，抑制精子活力，導(dǎo)致精子總活力下降，進(jìn)而影響精-卵結(jié)合，還可損傷精子 DNA，而精子 DNA的改變可以使有缺陷的 DNA傳給胎兒［1］。研究表明，活性氧在精子的DNA損傷中扮演重要角色［2］。因此，抗氧化藥物在男性不育治療中的應(yīng)用在國內(nèi)外均得到重視［3-4］。本研究通過誘導(dǎo)少弱精子癥大鼠，觀察強(qiáng)精煎對少弱精子癥大鼠附睪精子的抗氧化作用及其對睪丸、附睪上皮病理損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

MACRO精子計數(shù)板和CFT-9201X型CASA精子分析系統(tǒng)(江蘇瑞琪有限公司生產(chǎn));752型 紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司); HR801型酶標(biāo)儀(深圳華科瑞科技有限公司);掃描電子顯微鏡，廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供分析服務(wù)。

考馬斯亮藍(lán)蛋白、NOS、SOD、MDA、GSH-Px等試劑盒，來自南京建成生物工程研究所。

1.2 藥物

強(qiáng)精煎組成:菟絲子、枸杞各 20 g，當(dāng)歸、紫河車、神曲各10 g，黃芪、益母草各30 g，黨參、續(xù)斷、鹿角霜各15 g［5］，采用單味免煎中藥(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn));黃精贊育膠囊(由黃精、肉蓯蓉、淫羊藿、紫河車、黨參、當(dāng)歸、蛇床子、水蛭、牡蠣等組成)，上海新亞藥業(yè)邗江有限公司生產(chǎn);奧硝唑膠囊，購自四川百利藥業(yè)有限公司。

1.3 動物來源、分組及給藥方案

8～10周齡的60只SD雄性性成熟大鼠，體質(zhì)量(280±10)g，采購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，分組及給藥方法參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法，ORN用量加倍。模型組給予 ORN800 mg/kg，黃精贊育膠囊組給予 ORN (800 mg/kg)+黃精贊育膠囊(400 mg/kg)，強(qiáng)精煎組給予ORN(800 mg/kg)+強(qiáng)精煎(10 g/kg)，空白組給予生理鹽水，試驗(yàn)藥物混懸液使用生理鹽水配制［5］。各組溶液灌胃體積均為4 mL，每日1次，連續(xù)28 d，具體給藥劑量根據(jù)大鼠每7 d 1次的體質(zhì)量變化進(jìn)行適時調(diào)整。

1.4 大鼠附睪精子濃度及活力測定

最后1次灌胃24 h后，以10%濃度的Urethane腹腔注射法麻醉大鼠，剪開腹腔，仔細(xì)完整地分離一側(cè)附睪尾，迅速置于盛有2 mL 37℃的生理鹽水平皿中剪碎，混勻并溫浴片刻(30 s左右)［5］，待精子充分?jǐn)U散后，使用精子計數(shù)板和CASA檢測精子數(shù)量，并計算精子活力。

1.5 SOD、MDA、GSH-Px、NOS活力的測定

根據(jù)考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒所示方法，取單側(cè)附睪尾用4℃生理鹽水在冰水浴中制成10%的附睪組織勻漿，轉(zhuǎn)速3000 r/min離心10 min，收集上清液分批凍存，比色法測定附睪組織蛋白的含量。最后根據(jù)試劑盒步驟測定SOD、MDA、NOS、GSH-Px活性。

1.6 超微病理分析

以電鏡專用的2.5%戊二醛固定各組大鼠睪丸和附睪尾，4℃冰箱保存過夜、切片。電鏡超微掃描觀察生精上皮、精子數(shù)量等情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用PEMS3.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析多重比較，方差齊以 LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附睪精子濃度及活力

表1顯示，模型組精子濃度、活動率呈現(xiàn)明顯下降，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。強(qiáng)精煎組與黃精贊育膠囊組精子濃度、活動率接近，優(yōu)于模型組(P＜0.05)，與空白組仍有差異(P＜0.05)。這表明800 mg/kg劑量ORN不但嚴(yán)重?fù)p傷了精子活力，也嚴(yán)重?fù)p害睪丸的生精功能，導(dǎo)致精子生成數(shù)量顯著減少。強(qiáng)精煎及黃精贊育膠囊干預(yù)后的大鼠附睪精子數(shù)量、活力盡管低于空白組，但仍顯著高于模型組。由此可見，強(qiáng)精煎能修復(fù)ORN氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的生精損傷，保護(hù)生精功能，提高精子活力。

表1 強(qiáng)精煎對大鼠精子濃度、活力的影響(±s)

表1 強(qiáng)精煎對大鼠精子濃度、活力的影響(±s)

注:與模型組比較:△P＜0.05;與空白組比較:*P＜0.05

組別 鼠數(shù) 精子濃度(×106/ml) 活動率(%) 15 54.67±6.31 71.03±6.23模 型 組 15 10.60±2.64* 10.65±1.27*黃精贊育膠囊組 15 36.93±4.02 49.42±4.66強(qiáng) 精 煎 組 15 37.47±2.97＊△ 50.31±5.90空白組＊△

2.2 附睪勻漿MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力

表2顯示，與其余各組比較，模型組大鼠附睪NOS活力、丙二醛濃度升高(P＜0.05)。黃精贊育膠囊組、強(qiáng)精煎組丙二醛濃度接近，與模型組、空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。模型組超氧化物歧化酶、GSH-Px活力明顯下降，顯著低于空白組(P＜0.05)。黃精贊育膠囊組、強(qiáng)精煎組超氧化物歧化酶、GSH-Px活力均顯著優(yōu)于模型組(P＜0.05)，但仍不及空白組(P＜0.05)，說明強(qiáng)精煎增強(qiáng)了大鼠附睪內(nèi)抗氧化酶的活性，清除活性氧，抑制過度的氧化應(yīng)激，與本課題前期研究結(jié)論一致［5］。

表2 強(qiáng)精煎對大鼠附睪MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力的影響(±s)

表2 強(qiáng)精煎對大鼠附睪MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力的影響(±s)

注:與模型組比較:△P＜0.05;與空白組比較:*P＜0.05

組別 鼠數(shù) MDA(nmol·mg－1) SOD(NU·g－1) GSH-Px(NU·g－1) NOS(U/ml)空 白 組 15 6.24±1.27 109.60±13.55 34.64±5.80 1.58±0.61模 型 組 15 21.20±4.17* 47.86± 6.67* 12.03±1.68* 10.92±1.54*黃 精 贊 育 膠 囊 組 15 10.30±1.65△＊ 77.66± 5.96△＊ 20.12±2.76△ 1.82±1.55△強(qiáng) 精 煎 組 15 9.77±1.70△＊ 76.08± 9.32△＊ 20.16±2.47△＊ 1.69±0.52△

2.3 睪丸附睪超微病理

在強(qiáng)精煎組、黃精贊育膠囊組，生精上皮排列緊密，附睪上皮較為完整，生精活躍，與空白組尚存在一定差距(圖1、3、4);而模型組生精小管間隙增寬分離、空虛，生精上皮受損嚴(yán)重，層次大部分缺失，精子數(shù)量顯著少于其余各組(圖2)，比既往研究顯示出更為顯著的病理損傷［5］。

3 討論

ORN是常用的第三代硝基咪唑類藥物的衍生物。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大劑量奧硝唑?qū)π坌陨τ休^強(qiáng)的毒性作用，當(dāng)劑量達(dá)到800 mg/(kg·d)時，可導(dǎo)致大鼠睪丸質(zhì)量顯著減輕，精子細(xì)胞明顯減少，生精細(xì)胞大片脫落，精子日產(chǎn)量也顯著減少［6］。因此本實(shí)驗(yàn)使用該藥持續(xù)灌胃誘導(dǎo)出少弱精子癥大鼠模型。

ROS主要包括過氧化氫、O2－、OH－、一氧化氮等自由基，可危及細(xì)胞功能及存活。活性氧必須不停地被滅活，睪丸附睪中僅需保持一定的濃度且可受控制的活性氧以維持精子的生理功能。在生殖系統(tǒng)中，抗氧化系統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶以及其他血紅素蛋白過氧化物酶等構(gòu)成［5］。其中，超氧化物歧化酶能清除O2－尤為重要，能抵抗 ROS對精子產(chǎn)生的毒性，從而維持機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，SOD還與精子數(shù)量呈正相關(guān)［7］。谷胱甘肽過氧化酶主要是清除過氧化氫，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，若酶保護(hù)系統(tǒng)中某部分被削弱，該系統(tǒng)則會失效并引發(fā)永久的細(xì)胞損傷［5-8］。

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 黃精贊育膠囊組

圖4 強(qiáng)精煎組

精子質(zhì)膜中有多聚不飽和脂肪酸(PUFA)大量存在，其對過量ROS引起的損傷極其敏感，而存在于精子胞質(zhì)內(nèi)的ROS清除酶數(shù)量有限，其補(bǔ)充來源于精漿，從而維持自身的抗氧化系統(tǒng)。精子質(zhì)膜的流動性較為脆弱，能被生殖道內(nèi)過量的活性氧所破壞，導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，并對精子產(chǎn)生毒副作用。過高的活性氧引起精子膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，繼而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化及其降解產(chǎn)物，如丙二醛可使精子外觀結(jié)構(gòu)、功能及代謝異常，從而導(dǎo)致男性生育力受損［9-11］。過高的活性氧破壞精子DNA完整性，引起精子形態(tài)異常，并形成惡性循環(huán)［11］。丙二醛是氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的標(biāo)志物，是衡量體內(nèi)自由基產(chǎn)生程度的可靠指標(biāo)［5］。而一氧化氮合酶活性增強(qiáng)誘導(dǎo)NO生成增多，過量的NO可引起精子結(jié)構(gòu)改變，損傷精子活動能力。

筆者前期臨床研究表明，強(qiáng)精煎可顯著改善少弱精子癥患者的精子數(shù)量和活力，且有良好的安全性［13］。本研究中，強(qiáng)精煎組超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力明顯優(yōu)于奧硝唑模型組，而一氧化氮合成酶活力、丙二醛濃度顯著低于模型組;生精上皮較為完整，精子數(shù)量與活力均優(yōu)于奧硝唑模型組，可見強(qiáng)精煎中藥可增強(qiáng)生殖系統(tǒng)的抗氧化酶活性，拮抗氧化損傷，維持精子發(fā)生，提高精子活力。方中菟絲子、枸杞為子類藥物填補(bǔ)腎精，黨參、黃芪補(bǔ)氣健脾，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，牡蠣固精澀精，益母草活血清熱利濕，全方具有健脾補(bǔ)腎、清熱利濕兼活血之功。藥理實(shí)驗(yàn)表明，枸杞的有效成分枸杞多糖(LBP)能提高大鼠超氧化物歧化酶活性［14］，LBP還可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的睪丸生精細(xì)胞病理損傷［15-16］;菟絲子有效成分能增強(qiáng)精子懸液中超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛濃度［17］;黨參多糖可顯著降低大鼠Leydig細(xì)胞的丙二醛含量，增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶的活力［18］;五味子的活性成分既能增強(qiáng)抗氧化酶活性，又可清除氧自由基;紫河車多種酶有較強(qiáng)的抗氧化作用;黃芪原液體外添加于人類精子可提高其活力和活動率［19］;鹿茸、當(dāng)歸、續(xù)斷的有效成分也具有抗氧化應(yīng)激作用［20-21］。

綜上所述，強(qiáng)精煎能降低附睪丙二醛、一氧化氮合成酶含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等活力，使得生殖系統(tǒng)免受氧化應(yīng)激損傷，維持抗氧化酶系統(tǒng)，修復(fù)睪丸及附睪病理損傷，促進(jìn)精子發(fā)生，為中醫(yī)藥抗氧化治療少弱精子癥提供了新的方法。其不足之處在于對ORN的睪丸毒性研究尚未涉及，對中藥強(qiáng)精煎修復(fù)生精上皮、提高精子活力的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究。

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Experimental Study of Qiang Jing Jian's Anti Oxidative Effects of the Rats with Little Weak Sperm Induced by Ornidazole

BIN Bin，LU Hai-wang，WANG Jie，WANG De-sheng，XU Jie-xin，QIN Zhi-biao，LIANG Jing-song，PANG Qiu-hua，CUI Jin-zhu
(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi，Nanning 530023，China)

Objective:To study the antioxidant effect of Qiang Jing Decoction on epididymis sperms of rats with Ornidazole-Induced oligoasthenozoospermia.Method:60 rats were divided into 4 groups randomly.the model group were given ORN;rats in the Huangjing Zanyu Capsule group were given ORN and Huangjing Zanyu Capsule;rats in the Qiang Jing Decoction group were given ORN Qiang Jing Decoction granule;the blank group were given saline;the concentration and motility of rats’sperms and the epididymis homogenate activity of MDA，SOD，GSH-PX，and NOS as well as the ultrastructure changes of testis and epididymis were detected.Results:Compared to the blank group，the quantity and motility of rats’sperms and the activity of SOD and GSH-PX in model group were reduced significantly，the content of MDA and NOS were highly rose，In Qiang Jing Decoction group and Huangjing Zanyu Capsule group，the sperms quantity and motility and the activity of SOD and GSH-PX were reduced，but significantly higher than model group，while the activity of MDA and NOS significantly lower than the model group.The testis seminiferous epithelial were destroyed and the level structure showed incompletely and the sperm production were decreased.in the model group，while in Qiang Jing Decoction group and Huangjing zanyu Capsule group，the seminiferous epithelial were more completely and the sperm production was approached to the blank group.Conclusion:the Qiang Jing Decoction can enhance the activity of antioxidant enzymes，restraining oxidative stress injury and protecting the spermatogenic function.

Antioxidant;ROS;Oligoasthenozoospermia;Invigorating spleen and kidney;Qiang Jing Decoction

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0484-04

2015-08-06

國家自然科學(xué)基金資助項目(81060297)-健脾益腎法對少、弱精子癥大鼠的抗氧化作用及其調(diào)控機(jī)制的研究

賓 彬(1964-)，男，廣西平南人，教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事男科學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者:陸海旺(1986-)，男(壯族)，廣西南寧人，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事男科疾病的中醫(yī)藥臨床與研究，Tel: 15977462577，E-mail:haivang@163.com。