田 茸，鞏子漢，楊曉軼，朱立鳴，段永強，成映霞，杜 娟，王 燕

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州 730020)

【實驗研究】

CaM/CaMKⅡ在脾氣虛證大鼠腦腸微環(huán)境中的表達(dá)及四君子湯干預(yù)效應(yīng)研究*

田 茸1，鞏子漢2，楊曉軼2，朱立鳴2，段永強2，成映霞2，杜 娟2，王 燕2

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州 730020)

目的:從CaM信號通路關(guān)鍵基因揭示脾氣虛證發(fā)生及益氣健脾法干預(yù)作用機(jī)制。方法:脾氣虛證大鼠為研究對象，采用實時熒光定量RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測不同階段大鼠腦、腸CaM信號通路關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的動態(tài)表達(dá)，并分析四君子湯干預(yù)效應(yīng)機(jī)制。結(jié)果:從大鼠小腸組織看，脾氣虛證大鼠相對于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表達(dá)升高，經(jīng)四君子湯治療后明顯降低;從大鼠腦組織看，脾氣虛證大鼠相對于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表達(dá)降低，經(jīng)四君子湯治療后明顯升高。結(jié)論:腦腸微環(huán)境中CaM信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡ的動態(tài)表達(dá)與脾氣虛證形成有關(guān)，四君子湯通過影響其表達(dá)對脾氣虛證起到時相性動態(tài)干預(yù)。

脾氣虛證;四君子湯;腦;腸;CaM;CaMKⅡ

中醫(yī)學(xué)歸納“脾”為氣血生化之源、后天之本，主司運化、主統(tǒng)血、主肌肉四肢，脾氣虛證以面黃食少、泄瀉或便秘、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白、脈虛弱為臨床辨證要點。故脾氣虛證是以消化吸收功能障礙為主要表現(xiàn)，并涉及神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌、運動等系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂、營養(yǎng)物質(zhì)代謝低下的虛損性疾病狀態(tài)，是多系統(tǒng)和多器官功能衰弱的綜合病理變化［1］。鑒于中醫(yī)之“脾”是以消化系統(tǒng)為主體，并涉及多系統(tǒng)的綜合功能性單位，故本研究將靶標(biāo)定位到腦、腸微環(huán)境下，分別檢測大鼠腦和小腸CaM信號通路關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表達(dá)，從而探討脾氣虛證的形成機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探討四君子湯對脾氣虛證的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

采用SPF級 Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量(170± 20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心提供(動物合格證號 SCXK［甘］2011-0001-0001011)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量編號依照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型14 d組、模型21 d組、模型28 d組、四君子湯14 d組、四君子湯21 d組、四君子湯28 d組，分籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑

造模藥材大黃、枳實、厚樸(4∶2∶3)，灌胃藥材人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草(3∶3∶3∶2)，購自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司，常規(guī)煎煮，濾液濃縮至折合原藥材質(zhì)量濃度2 g/ml備用。主要實驗試劑:辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L，批號ZB-2301)，Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co Ltd;總蛋白提取試劑盒(批號 PC0020)，北京普利萊基因技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法，批號P1511)，北京普利萊基因技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號0000036802)，美國 Promega公司;實時熒光 定 量 PCR 試 劑 盒 (批 號 0000036802，0000042197)，美國 Promega公司;Cam、CaMKⅡ引物，寶生物工程(大連)有限公司;Anti-Calmodulin antibody，Rabbit monoclonal［EP799Y］to Calmodulin，ab45689)，abcam公司(1/1000-1/5000);Anti-CaMKⅡ antibody:Rabbit monoclonal［EP1829Y］to CaMKⅡ，ab52476)，abcam公司(1/20000)。

1.3 模型復(fù)制及給藥

1.3.1 模型復(fù)制 以苦寒破氣加游泳力竭雙因素法復(fù)制脾氣虛證模型。苦寒破氣法:模型組大鼠每日按7.5 g/kg·d大黃枳實厚樸制劑液灌胃;游泳力竭法:大鼠每日負(fù)重游泳，于大鼠尾根部纏繞質(zhì)量為該大鼠體質(zhì)量 10% 的保險絲，放入水深 50 cm、20℃的水槽中游泳，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒入水面10 s)為度，判定游泳力竭。脾氣虛證模型復(fù)制成功評估標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部藥政局頒布的《中藥治療脾氣虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》擬定:①蜷縮扎堆1分;②瞇眼弓背1分;③食量減少1分;④體質(zhì)量減輕1分;⑤便形質(zhì)軟1分;⑥便形溏稀2分;⑦肛溫下降2分;⑧游泳耐力下降1分。9項癥狀表現(xiàn)中出現(xiàn)6項則可判斷為脾氣虛證。結(jié)合評估標(biāo)準(zhǔn)以及大鼠體質(zhì)量增長幅度、進(jìn)食量、游泳力竭時間、胃殘留率、小腸推進(jìn)率等定量指標(biāo)評判大鼠脾氣虛證模型復(fù)制成功。

1.3.2 分組給藥 各四君子湯組大鼠在造模7 d后繼續(xù)造模的同時，每天以四君子湯20 g/kg·d藥劑灌胃進(jìn)行干預(yù)治療，灌胃容積均為1 ml/100 g，連續(xù)灌胃3周(四君子湯用藥量以臨床等效劑量為標(biāo)準(zhǔn)，實驗等效劑量按人與動物體型系數(shù)折算［2］，相當(dāng)于60 kg成人每日臨床用量的10倍)。正常對照組、各模型組以相應(yīng)等體積的蒸餾水灌胃28 d。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 取材 實驗于14 d、21 d、28 d末分別斷椎處死相關(guān)組別大鼠，冰臺上迅速取腦，分離海馬組織，并截取十二指腸上段組織備用。

1.4.2 實時熒光定量 PCR檢測各組大鼠小腸、腦組織CaM/CaMKⅡ基因表達(dá) 組織總RNA提取與質(zhì)量檢測及反轉(zhuǎn)錄合成模板 cDNA:取適量各樣本組織，分別取1 μL各組織RNA樣品用核酸定量分析儀測定其 OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的RNA符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作，所得的單鏈 cDNA放置于－20℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計與實時熒光定量PCR:從NCBI中查尋目標(biāo)基因ID及序列，由TAKARA公司設(shè)計和合成目標(biāo)基因引物。β-actin引物序列，上游:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游:5'-GAC TCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，擴(kuò)增長度:150 bp; CaM引物序列，上游:5'-TCAGAACCCAACAGAGG CTGAA-3'，下游:5'-GTCAAAGACTCGGAATGCCT CAC-3'，擴(kuò)增長度:160 bp;CaMKII引物序列，上游: 5'-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3'，下游:5'-ATGT AGGCGATGCAGGCTGAC-3'，擴(kuò)增長度:183 bp。實時熒光定量PCR以β-Actin作為內(nèi)參基因，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。連續(xù)檢測熒光并記錄擴(kuò)增曲線，采用樣點擬合法分析結(jié)果得到目的基因和 β-actin的Ct值，用比較Ct值法計算相對表達(dá)量。

1.4.3 Western blot檢測各組大鼠小腸、腦組織CaM/CaMKⅡ蛋白表達(dá) 組織蛋白提取:分別將小腸、腦組織裂解剪成碎片勻漿，直至95%的細(xì)胞被破碎，離心后吸取上清液得組織總蛋白產(chǎn)物并蛋白純化。蛋白定量:組織蛋白定量檢測采用 BCA (Bicinchoninic acid)蛋白質(zhì)測定方法，以 BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)所測樣本的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算樣品的蛋白含量;樣本組織蛋白變性:分別取各組織樣本300 μL于離心管中，再加入100 μL 4×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液充分混勻，沸水(100℃)中水浴10 min冰水浴冷卻，－20℃冰箱保存;溶液配制;制膠與電泳;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，打開轉(zhuǎn)移夾，PVDF膜上可見清晰的預(yù)染 Marker，表明蛋白已轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，根據(jù)抗體說明中目標(biāo)抗體的分子量分大小確定目標(biāo)蛋白位置;免疫檢測:將PVDF膜放入適量封閉液中，37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，放入平皿中，并加入相應(yīng)的一抗溶液(GAPDH一抗溶液配制(1∶700):牛奶封閉液7 ml，GAPDH一抗10 ul; CamKⅡ一抗溶液配制(1∶10000):封閉液10 ml，CamKⅡ一抗1 ul;Cam一抗溶液配制(1∶500):封閉液5 ml，Cam一抗1 ul、37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，再將PVDF膜放置于10 mlTBST溶液中，搖床上洗膜3次、10 min/次，將洗好的 PVDF膜放于配制好的二抗溶液(二抗溶液配制:辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶7500):山羊抗兔二抗 2 μL，牛奶封閉液 15 ml)，搖床上孵育2 h再洗膜;采用 ECL法顯色，并根據(jù)不同顯影光強度調(diào)整曝光條件，用 Bio-RAD Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。結(jié)果用Quantity one分析光密度值對蛋白含量進(jìn)行分析，以β-actin與目的蛋白密度比值作為待測目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。首先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性者不同組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況改變

正常對照組大鼠飲食、活動、大便性狀及毛發(fā)等均無異常，體質(zhì)量穩(wěn)定逐漸增加。各模型組大鼠從14 d開始逐漸出現(xiàn)活動減少、毛發(fā)枯槁(背脊毛色從白到紅再轉(zhuǎn)黃)，逐漸出現(xiàn)瞇眼弓背，喜扎堆，體質(zhì)量下降，進(jìn)食量減少，大便稀軟;造模21 d后部分大鼠出現(xiàn)大便稀溏，少數(shù)出現(xiàn)水樣便或肛門脫垂;造模28 d多數(shù)大鼠便質(zhì)清稀，少數(shù)出現(xiàn)便秘。各四君子湯組大鼠的一般情況均較模型組有所改善，并隨著治療時間的延長，大鼠進(jìn)食量增加、活動增多，瞇眼弓背和扎堆現(xiàn)象減少，大便性狀接近正常。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、游泳力竭時間的動態(tài)變化

表1顯示，模型組大鼠在造模14 d時與正常對照組比較，體質(zhì)量、進(jìn)食量、游泳力竭時間均明顯偏低(P＜0.01，P＜0.05);隨造模時間延長，此3項指標(biāo)均呈下降趨勢，明顯落后于正常對照組(P＜0.01)。四君子湯組在造模和治療初期與正常對照組比較，體質(zhì)量、進(jìn)食量、游泳力竭時間明顯偏低(P＜0.01，P＜0.05)，經(jīng)過28 d的治療，體質(zhì)量增長幅度至每7 d增長13～15 g，但由于體質(zhì)量基數(shù)低，故仍低于正常對照組(P＜0.01)卻明顯高于模型組(P＜0.01)，每日進(jìn)食量及游泳力竭時間均有所增加，基本接近正常對照組且高于模型組(P＜0.01)。

表1 治療14 d大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、游泳時間表

2.3 各組大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率動態(tài)變化

表2顯示，隨造模時間延長模型組大鼠與正常對照組比較，胃殘留率、小腸推進(jìn)率呈升高趨勢，到28 d時均明顯高于正常對照組(P＜0.01，P＜0.05);四君子湯組在造模和治療初期與正常對照組比較，胃殘留率略低，小腸推進(jìn)率略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過28 d的治療，胃殘留率、小腸推進(jìn)率有所降低，均明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率比較

2.3 各組大鼠腦、小腸組織 CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相對表達(dá)量 表3、4顯示，通過實時熒光定量RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示，腦組織中模型組大鼠CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白的表達(dá)隨造模時間的延長呈下降趨勢，在造模第21、28天時，其表達(dá)明顯低于正常對照組(P＜0.01)。四君子湯組在治療初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表達(dá)也略低于正常對照組，隨治療時間的延長表達(dá)逐漸升高，至治療第21、28天時其表達(dá)明顯高于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。從小腸組織看，模型組大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相對表達(dá)，隨造模時間的延長呈上升趨勢，在造模第21、28天時其表達(dá)明顯高于正常對照組(P＜0.01，P＜0.05)。四君子湯組在治療初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表達(dá)也略高于正常對照組，隨著治療時間的延長表達(dá)逐漸降低，至治療第21、28天時其表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.01)。

3 討論

中醫(yī)證候的客觀化研究是中醫(yī)學(xué)發(fā)展和完善的前提和基礎(chǔ)。脾氣虛證是脾病辨證中的基礎(chǔ)證，加之脾氣虛證牽涉多臟器、多系統(tǒng)，故本課題基于細(xì)胞信號傳導(dǎo)理論，將與機(jī)體多系統(tǒng)多臟器生理功能密切相關(guān)的鈣調(diào)蛋白信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡ的表達(dá)作為檢測指標(biāo)，提出“CaM信號傳導(dǎo)途徑在脾氣虛證腦腸微環(huán)境中的可能作用機(jī)制”工作假說，從而對脾氣虛證證候?qū)嵸|(zhì)進(jìn)行客觀化研究。

表3 各組大鼠腦、小腸組織CaM/CaMKⅡmRNA相對表達(dá)量比較

表4 各組大鼠腦、小腸組織CaM/CaMKⅡ蛋白相對表達(dá)量比較

研究結(jié)果證明，復(fù)制脾氣虛證模型的大黃枳實厚樸活性物質(zhì)苦寒破氣，有可能影響到胃蠕動，使胃排空時間延長并導(dǎo)致食積，同時又興奮小腸平滑肌，使得小腸收縮功能亢進(jìn)導(dǎo)致泄瀉，說明大黃枳實厚樸成功復(fù)制了脾氣虛證模型，模擬了脾氣虛證患者的神疲乏力、少氣懶言、倦臥多寐、胃納不香、納食減少、停食積食、大便稀溏及小兒出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩等癥狀。經(jīng)過四君子湯活性物質(zhì)益氣健脾，促進(jìn)胃蠕動，縮短胃排空時間，減少食積的發(fā)生，同時調(diào)節(jié)小腸的推進(jìn)功能，加強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而改善大鼠的一般情況，恢復(fù)體質(zhì)量增長幅度，加強運動耐力并改善便質(zhì)，說明四君子湯能從整體上改善脾氣虛證患者的一般情況，對脾氣虛證相應(yīng)癥狀都有很好的治療效果。

從證候?qū)嵸|(zhì)的角度發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證證候與腦腸中CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表達(dá)水平之間存在動態(tài)多時相效應(yīng)關(guān)系，即脾氣虛證大鼠隨造模時間的延長，與正常大鼠比較小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，腦組織中 CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，說明大黃枳實厚樸活性物質(zhì)具有增強大鼠小腸組織中CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)，并抑制大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)的作用，揭示了脾氣虛證證候的細(xì)胞信號通訊機(jī)制。與此同時，在遵循傳統(tǒng)中醫(yī)治則治法理論基礎(chǔ)上，通過觀察益氣健脾法的代表方劑四君子湯對脾氣虛證大鼠的干預(yù)作用發(fā)現(xiàn)，隨四君子湯治療時間的延長，與脾氣虛證大鼠比較治療后大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，說明四君子湯活性物質(zhì)具有抑制脾氣虛證大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)，并促進(jìn)脾氣虛證大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)的作用。從基因和蛋白水平探尋到中醫(yī)藥治療脾氣虛證證候的作用靶位和機(jī)制，為今后進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥治療脾氣虛證多時相、多靶點的科學(xué)內(nèi)涵打下基礎(chǔ)。

［1］ 錢澤南，錢會南.脾氣虛證與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機(jī)制研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，37(3):401-403.

［2］ 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:33-34.

Expression of CaM/CaMK II and the Intervention effect of Si Jun Zi Decoction in the Brain and Intestine Micro-environment of Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

TIAN Rong1，GONG Zi-han2，YANG Xiao-yi2，ZHU Li-ming2，DUAN Yong-qiang2，CHENG Ying-xia2，DU Juan2，WANG Yan2
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China; 2.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)

Objective:To reveal the mechanism about the expressions of key genes of CaM signal pathway of the spleen qi deficiency rats，and the intervention effects about strengthening spleen and benefiting qi.Methods:We took the spleen qi deficiency rats as the targets，We detected dynamic expressions of critical genes CaM/CaMKⅡmRNA and protein on CaM signaling pathway in brain and intestine microenvironments at different time by technique methods of real-time quantitative RT-PCR and Western Blot.At the same time we studied on the intervention effect mechanism of Sijunzi Decoction to treat spleen qi deficiency rats.Results:1 Rat intestinal detection index:Spleen qi deficiency rats intestinal CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats intestinal CaM/ CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with spleen qi deficiency rats.2 Rat brain detection index: Spleen qi deficiency rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with spleen qi deficiency rats.Conclusions:The dynamic expressions of key genes CaM/CaMKⅡof CaM signal pathway in brain and intestine microenvironment，which is the basis for spleen qi deficiency syndrome.Sijunzi Decoction treated spleen qi deficiency by affecting the dynamic expressions of CaM/CaMKⅡ.

Spleen deficiency;Sijunzi Decoction;Brain;Intestine;CaM;CaMK Ⅱ

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0468-04

2015-08-06

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160420);甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(1010RJZA148);甘肅省教育廳基金資助項目(1006-05)

田 茸(1978-)，女，主治醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治脾胃病的臨床與實驗研究。