孫 菲，孫 欣，金 榮

(黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 雞西 158100)

反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定香菊膠囊中綠原酸和咖啡酸含量

孫 菲，孫 欣，金 榮

(黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 雞西 158100)

目的 建立同時(shí)測(cè)定香菊膠囊中綠原酸和咖啡酸含量的反相高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流動(dòng)相為乙腈－甲醇－0．2%磷酸溶液(線性梯度洗脫)，檢測(cè)波長(zhǎng)328 nm，流速1．0 mL／min，進(jìn)樣量20 L，柱溫 30℃。結(jié)果 綠原酸和咖啡酸進(jìn)樣量分別在2．034×10－2～5．085×10－1g(r＝0．999 9，n＝7)和 2．218×10－2～5．545×10－1g (r＝0．999 9，n＝7）時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率分別為98．83%和98．72%(RSD分別為0．86%，0．88%，n＝6)。結(jié)論 該法操作快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、結(jié)果可靠，可用于香菊膠囊的質(zhì)量控制。

香菊膠囊；含量測(cè)定；綠原酸；咖啡酸；高效液相色譜法

香菊膠囊由化香樹(shù)果序（除去種子）、夏枯草、野菊花、黃芪、辛夷、防風(fēng)、白芷、甘草、川芎9味中藥組方，具有辛散祛風(fēng)、清熱通竅之功效[1]，用于急、慢性鼻竇炎及鼻炎的療效顯著[2]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芪有效成分黃芪甲苷的含量測(cè)定，無(wú)對(duì)處方中主要成分野菊花的質(zhì)量控制方法。綠原酸和咖啡酸為野菊花中的有效成分[3－4]，兩者含量可以作為香菊膠囊中野菊花質(zhì)量好壞的評(píng)定依據(jù)。目前，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道香菊膠囊中綠原酸和咖啡酸的含量測(cè)定方法。為此，筆者建立了同時(shí)測(cè)定香菊膠囊中綠原酸和咖啡酸含量的高效液相色譜法，專屬性強(qiáng)，可為香菊膠囊中野菊花的質(zhì)量控制提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

HP 1100型高效液相色譜儀，包括四元泵、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、HP 1100工作站；XSE 205型電子天平（METTLER TOLEDO公司）；JAC－40型超聲波清洗器（功率100 W，頻率40 kHz，濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司）；UV－2550型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器＜蘇州＞有限公司）。

1．2 試藥

咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)為110885－201102，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為 110753－201314，中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量為96．6%）；香菊膠囊（批號(hào)140416，140418，140312，山東步長(zhǎng)制藥有限公司）；水為純化水，其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentZorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A)－甲醇（B）－0．2%磷酸溶液(C)，線性梯度洗脫，5%A－5%B（0 min），5%A－5%B（30 min），20%A－20%B（40 min），5%A－5%B（50 min），5%A－5%B（60 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1．0 mL／min。在此條件下，綠原酸和咖啡酸色譜峰的分離度大于1．5，理論板數(shù)以咖啡酸色譜峰計(jì)不低于4 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2．2 溶液制備

分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)夜的咖啡酸和綠原酸對(duì)照品11．09 mg和10．53 mg（含量為96．6%），置同一10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品貯備液。

精密稱取香菊膠囊樣品適量（約1 g），置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液35 mL，超聲提取35 min（功率為100 W，頻率為40 kHz），放置20 min，冷卻至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，備用，得供試品溶液。

按香菊膠囊的處方[5]和工藝，不加入野菊花藥材，依法制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取混合對(duì)照品貯備液2．0 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)。按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣1，2，4，8，12，16，25 μL，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，綠原酸：Y＝2．839×103X－1．683，r＝0．999 9（n＝7），綠原酸進(jìn)樣量在 2．034×10－2～5．085×10－1μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；咖啡酸：Y＝5．075×103X－1．316，r＝0．999 9（n＝7），咖啡酸進(jìn)樣量在2．218×10－2～5．545×10－1μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品貯備液1．0 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，得綠原酸和咖啡酸質(zhì)量濃度分別為20．34和22．18 μg／mL的混合對(duì)照溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次 20 μL，記錄色譜峰面積，結(jié)果的 RSD分別為0．4%和0．3%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取香菊膠囊樣品適量，按供試品溶液制備溶液，按擬訂色譜條件，設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣器，分別于0，1，2，4，10，16，24 h時(shí)重復(fù)進(jìn)樣，每次20 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果的 RSD分別為0．7%和 0．3%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取香菊膠囊（批號(hào)為140416）適量，依法制備供試品溶液5份，按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果每粒膠囊中綠原酸和咖啡酸的平均含量分別為0．148 mg和0．091 mg，RSD分別為0．7%和0．5%（n＝5），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密稱取香菊膠囊（批號(hào)為140416）0．16 g，稱取6份，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為37．05 μg／mL）和咖啡酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為 22．18 μg／mL）各2．0 mL，加50%甲醇溶液適量，超聲提取35 min，靜置至室溫，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批市售樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3．1 測(cè)定波長(zhǎng)確定

分別取綠原酸、咖啡酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，依照紫外分光光度法，分別于200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，咖啡酸和綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為323 nm和328 nm，選擇328 nm波長(zhǎng)時(shí)分離效果更好。

3．2 色譜條件篩選

流動(dòng)相分別考察了甲醇－0．2%磷酸溶液、乙腈－0．2%磷酸溶液、甲醇－乙腈－0．2%磷酸溶液，結(jié)果以甲醇－0．2%磷酸溶液、乙腈－0．2%磷酸溶液二元體系的流動(dòng)相進(jìn)行線性梯度洗脫，綠原酸和咖啡酸分離效果不理想，分離度不符合要求；以甲醇－乙腈－0．2%磷酸溶液三元體系流動(dòng)相梯度洗脫綠原酸和咖啡酸分離較好，柱效高。另外，綠原酸性質(zhì)不穩(wěn)定，見(jiàn)光易分解[6]，應(yīng)當(dāng)全部采用棕色瓶，并注意避光。

3．3 提取方法考察

分別以20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇作溶劑超聲提取30 min，測(cè)定綠原酸和咖啡酸的含量。以50%甲醇為溶劑時(shí)，提取效果好，與文獻(xiàn)[7]結(jié)果相同。另外，以50%甲醇為溶劑溶解樣品，分別超聲提取10，20，30，35，40，50 min，結(jié)果超聲35 min提取完全。

3．4 試驗(yàn)不足

野菊花作為香菊膠囊處方中的臣藥，其質(zhì)量直接影響藥效，綠原酸、咖啡酸和蒙花苷為野菊花中重要的指標(biāo)成分，因蒙花苷在該色譜條件下保留時(shí)間較長(zhǎng)，本試驗(yàn)中未能建立同時(shí)測(cè)定野菊花中3種成分的方法，蒙花苷可選用其他色譜條件單獨(dú)測(cè)定含量。

[1]WS3－161(Z－151)－2001(Z)，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[S]．

[2]王桂安，李 歌，杜 蕾，等．香菊膠囊治療慢性鼻－鼻竇炎的臨床療效分析[J]．中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11(1):598－600．

[3]郭巧生，房海靈，申海進(jìn)．不同產(chǎn)地野菊花中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷含量測(cè)定[J]．中國(guó)中藥雜志，2010，35（9）：1 160－1 162．

[4]彭 朋，程雪梅，劉 力，等 ．野菊花提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中國(guó)藥事，2010，24(7):650－654．

[5]王 珂，雷國(guó)蓮，王西芳，等．微波干燥應(yīng)用在香菊膠囊生產(chǎn)中的可行性研究[J]．現(xiàn)代中醫(yī)藥，2008，28(2):63－65．

[6]顧利紅，朱品業(yè)．日光和溫度對(duì)綠原酸供試液穩(wěn)定性的影響[J]．中成藥，1999，21（11）：568．

[7]程令梅，李桂冬．HPLC法測(cè)定珍菊降壓片中野菊花綠原酸的含量[J]．化學(xué)分析計(jì)量，2007，16（1）：48－49．

Simultaneous Content Determination of Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Xiangju Capsules by RP－HPLC

Sun Fei,Sun Xin,Jin Rong
(Jixi Food and Drug Testing Center,Jixi,Heilongjiang,China 158100)

Objective To establish an RP－HPLC method for simultaneous content determination of chlorogenic acid and caffeic acid in Xiangju Capsules．M ethods The Agilent Zobax SB－C18colume(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used;the mobile phase was acetonitrile－methanol－0．2%H3PO4by gradient elution and the detection wavelength was 328 nm;the flow rate was 1．0 mL／min,the injection volume was 20 μL,and the column temperature was 30℃．Results The linear response of chlorogenic acid ranged from 2．034× 10－2－5．085×10－1μg(r＝0．999 9，n＝7),and the linear response of caffeic acid ranged from 2．218×10－2－5．545×10－1μg(r＝0．999 9，n＝7);the average recovery rate of chlorogenic acid was 98．83%(RSD＝0．86%，n＝6),and the average recovery of caffeic acid was 98．72%(RSD＝0．88%，n＝6)．Conclusion The method is convenient,quick and accurate,and can be used for the quality control of Xiangju Capsules．

Xiangju Capsules;content determination;chlorogenic acid;caffeic acid;HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)09－0065－03

孫菲（1981－），女，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)，（電話）0467－6103277（電子信箱）chenlizhu1980＠163．com。

2016－01－10；

2016－02－19)