姚卓賢，馮 凱

（江蘇省常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 213001）

紅景天口服液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧耐受性的影響研究

姚卓賢，馮 凱

（江蘇省常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 213001）

目的 觀察紅景天口服液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧耐受性的改善作用。方法 將40只雄性SD大鼠乳鼠，按體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組。溶劑對(duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水20 L／mL，陽(yáng)性對(duì)照組給予氟桂嗪膠囊20 g／mL，紅景天組給予紅景天口服液20 L／mL。大鼠心肌細(xì)胞提取后常規(guī)培養(yǎng)10 d，更換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組在正常環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組心肌細(xì)胞放入溫度為37℃及CO2濃度為5%、O2濃度為1%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理，缺氧時(shí)間為6 h。缺氧后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒的要求分別測(cè)試乳酸脫氫酶、丙二醛、肌酸激酶、超氧化物歧化酶的水平。取余下細(xì)胞，按凱基細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的要求用流式細(xì)胞儀測(cè)試細(xì)胞凋亡的情況，用MTT法測(cè)試心肌細(xì)胞的活力水平。結(jié)果 紅景天口服液能顯著提高大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞在缺氧條件下的活力，減少細(xì)胞凋亡，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥（P＜0．01）；并且可降低原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞因缺氧所致心肌酶升高，有較好的清除氧自由基作用和對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥(P＜0．01)。結(jié)論 紅景天口服液可明顯提高大鼠心肌細(xì)胞的缺氧耐受性，為臨床治療缺氧性心肌病提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)資料。

紅景天口服液；大鼠；心肌細(xì)胞；缺氧；耐受性

紅景天(Rhodiola rosea)為景天科多年生草木或灌木植物，生長(zhǎng)在海拔800～2 500 m高寒無污染地帶的珍稀野生植物。20世紀(jì)60年代蘇聯(lián)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，它具有適應(yīng)原樣作用，可協(xié)助身體回復(fù)穩(wěn)態(tài)，加強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)物理、化學(xué)和生物學(xué)等各種有害刺激與損傷的非特異性抵抗力，使紊亂的機(jī)能恢復(fù)正常?，F(xiàn)代藥理研究表明[1]，紅景天具有抗缺氧、抗菌、抗氧化、提高免疫力等作用。為此，筆者觀察了紅景天口服液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧耐受性的改善作用，旨在為臨床治療缺氧性心肌病提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

藥品與試劑：高山紅景天口服液（杭州華威藥業(yè)有限公司，批號(hào)為140701，規(guī)格為每支10 mL）；鹽酸氟桂利嗪膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號(hào)為150306692，規(guī)格為每粒5 mg）；氯胰酶（Gibco公司分裝）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，每瓶200 mL），5－Brud（sigma公司，上海浩然生物技術(shù)有限公司分裝，每瓶500 mg）；噻唑藍(lán)（MTT，AMRESCO 公司，批號(hào)為L(zhǎng)J0628A5010J）。乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20130807）；丙二醛（MDA）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20130731）；肌酸激酶（CK）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20131031）；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)為 20130813）；凱基 Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為20130709）。

動(dòng)物：雄性ICR清潔級(jí)大鼠乳鼠，由蘇州大學(xué)動(dòng)物房提供。

儀器：MCO－15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司），3131型三氣培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司），BCM－1000A型生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），L－500型低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），multiskan MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾＜上海＞儀器有限公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（BD公司），電子計(jì)時(shí)器，1 mL注射器，密封廣口瓶。

1．2 方法

1．2．1 試驗(yàn)分組與給藥

取雄性SD大鼠乳鼠40只，單籠喂養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組。提取心肌細(xì)胞，溶劑對(duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水20 μL／mL，陽(yáng)性對(duì)照組給予氟桂嗪膠囊20 μg／mL，紅景天組給予紅景天口服液20 μL／mL，正常環(huán)境培養(yǎng)10 d。

1．2．2 試驗(yàn)方法

取2～3日齡SD大鼠乳鼠，放入75%酒精中浸泡消毒1 min，取出后開胸取心臟放入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS液)中。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm小碎塊，并用PBS液反復(fù)洗滌。取用2．0 g／L的胰蛋白酶10 mL，37℃消化10 min，加入1 mL胎牛血清終止消化，200目網(wǎng)篩濾過，2 000 r／min離心取沉淀后用含 10%FBS、10%胎牛血清、1%青鏈霉素及0．1 mmol／L 5－Brud的 DMEM培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中。37℃及5%的CO2、飽和濕度下培養(yǎng)貼壁1．0 h，收集未貼壁細(xì)胞，即為純度較高的心肌細(xì)胞。離心，計(jì)數(shù)后隨機(jī)接種在24孔板中，放在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[2－4]。

心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)10 d后，更換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組在正常環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組心肌胞放入溫度為37℃及CO2濃度為5%、O2濃度為1%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理，缺氧時(shí)間為6 h。缺氧后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒的要求分別測(cè)試LDH，MDA，CK，SOD的水平。取余下細(xì)胞，按凱基細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的要求用流式細(xì)胞儀測(cè)試細(xì)胞凋亡的情況，用MTT法測(cè)試心肌細(xì)胞的活力水平。

1．2．3 檢測(cè)指標(biāo)

細(xì)胞凋亡指數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞上清液酶學(xué)指標(biāo)(LDH，MDA，CK，SOD)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 對(duì)原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞活力的影響

用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞(溶劑對(duì)照組)活力為0．923%，經(jīng)過缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞(模型對(duì)照組)活力為0．303%，顯著低于未經(jīng)缺氧的溶劑對(duì)照組(P＜0．05)，說明缺氧對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力有較大影響。陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組心肌細(xì)胞的活力分別為0．359%和0．487%，說明紅景天口服液能提高缺氧培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞活力，與模型對(duì)照組比較心肌細(xì)胞活力升高非常顯著(P＜0．01)，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。見表1。

表1 紅景天口服液口服對(duì)缺氧培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞活力的影響(s，n＝10)

表1 紅景天口服液口服對(duì)缺氧培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞活力的影響(s，n＝10)

注：與模型對(duì)照組比較， P＜0．05，＃P＜0．01。下表同。

組別溶劑對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組紅景天組劑量( g／mL) 20 20細(xì)胞活力(%) 0．923±0．022 0．303±0．011 0．359±0．008 0．487±0．007＃

2．2 對(duì)原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過凋亡檢測(cè)試劑盒處理后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡指數(shù)為7．11%，模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡指數(shù)為18．2%，陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組分別為13．5%和12．3%，說明紅景天口服液能降低缺氧培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，與模型對(duì)照組比較心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降非常顯著(P＜0．01)，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。見表2。

表2 紅景天口服液對(duì)缺氧培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的影響(s，n＝10)

表2 紅景天口服液對(duì)缺氧培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的影響(s，n＝10)

組別溶劑對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組紅景天組劑量( g／mL) 20 20凋亡指數(shù)(%) 7．11±0．55 18．2±3．13 13．5±2．65 12．3±1．23＃

2．3 對(duì)原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞上清液酶的影響

LDH與CK：模型對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比，LDH與CK顯著增加，說明常壓缺氧環(huán)境下對(duì)心肌細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組的LDH和CK均有不同程度的降低，以LDH為例，模型對(duì)照組為1 544 U／L，陽(yáng)性對(duì)照組為1 088 U／L，紅景天組為855 U／L，說明紅景天口服液對(duì)保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞、減輕因細(xì)胞壞死造成心肌酶的溢出有較好的保護(hù)作用。見表3。

表3 紅景天口服液對(duì)原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響(s，n＝10)

表3 紅景天口服液對(duì)原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響(s，n＝10)

組別酶指標(biāo)溶劑對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組紅景天組LDH（U／L）622±188 1 544±323 1 088±345 855±238＃CK（U／mL）0．39±0．16 1．42±0．55 0．91±0．42 0．88±0．34＃MDA（nmol／mL）0．58±0．31 2．75±1．03 2．02±0．34 1．83±0．55＃SOD（U／mL）17．0±0．73 6．23±2．13 10．1±2．21 11．5±1．97

MDA與SOD：模型對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比，MDA含量顯著上升，SOD含量顯著下降，說明缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，SOD的活性受到抑制。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和紅景天組培養(yǎng)細(xì)胞上清液中MDA濃度降低，SOD含量升高，說明紅景天口服液對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧引起的氧化應(yīng)激有較好的保護(hù)作用。見表3。

3 討論

氧對(duì)維持機(jī)體生命活動(dòng)十分重要，缺氧可對(duì)機(jī)體造成多方面的損害：首先將對(duì)中樞神經(jīng)造成損傷，導(dǎo)致腦水腫甚至神經(jīng)元不可逆壞死；導(dǎo)致心功能降低，微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致全身重要臟器的供血不足；還將產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損，引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，提高缺氧耐受力，能有效保護(hù)缺氧損傷。

相關(guān)藥理學(xué)研究已證實(shí)，紅景天具有明顯改善心肌缺血缺氧、降低心肌耗氧量、保護(hù)損傷心肌等作用[5]。龍怡等[6]通過體外缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷模型，分別測(cè)定細(xì)胞MTT，LDH和MDA的變化，觀察紅景天單體成分紅景天苷、酪醇、沒食子酸、德欽紅景天苷、草質(zhì)素－7－O－(3′－β－D－葡萄糖)－α－L－鼠李糖苷5種成分對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，5種單體成分均有不同程度的促細(xì)胞活力，降低LDA和MDA的含量，其中單體成分紅景天苷、酪醇能明顯上調(diào)HIF－1α mRNA的表達(dá)。表明紅景天有明顯抗缺氧作用，5種單體成分對(duì)缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與上調(diào)HIF－1αmRNA的表達(dá)相關(guān)。

本研究通過大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)，分別從細(xì)胞水平和分子水平證實(shí)了紅景天口服液能提高大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的缺氧耐受性。紅景天組可顯著增加缺氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力，降低心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，且效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組選擇的西藥氟桂利嗪；紅景天組能顯著降低CK，LDH的表達(dá)及MDA濃度，提高SOD表達(dá)，表明紅景天口服液能顯著降低氧化應(yīng)激引發(fā)的脂質(zhì)過氧化程度，具有顯著的缺氧心肌損傷的保護(hù)作用。故可認(rèn)為，紅景天口服液提高缺氧耐受力的作用機(jī)制與降低脂質(zhì)過氧化、保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。

綜上所述，紅景天口服液能顯著提高大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞在缺氧條件下的活力，減少細(xì)胞凋亡；并且能降低原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞因缺氧所致心肌酶的升高，有較好的清除氧自由基的作用，顯示出對(duì)缺氧心肌細(xì)胞較好的保護(hù)作用。

[1]滕靜如，熊佳鵬，肖 誠(chéng)，等．紅景天的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12（4）：319－320．

[2]郝 然，婁金麗，張?jiān)蕩X，等．參麥注射液對(duì)缺氧心肌細(xì)胞凋亡的影響[J]．中國(guó)病理生理雜志，2007，23（4）：660－663．

[3]余 偉，王 偉，陳純娟，等．白黎蘆醇對(duì)大鼠缺氧心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及對(duì)SIRTI表達(dá)的影響[J]．中國(guó)老年心腦血管病雜志，2009，11（5）：365－368．

[4]李雪蓮，關(guān)會(huì)林，王 璐，等．丹參酮ⅡA調(diào)劑 microRNA－1保護(hù)缺氧心肌的作用[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，28（14）：5 463－5 466．

[5]王秋爽．大株紅景天注射液治療穩(wěn)定型心絞痛的療效觀察[J]．中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2013，23（8）:4 606．

[6]龍 怡，李佳川，孟憲麗．紅景天有效成分對(duì)缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究[J]．中藥藥理與臨床，2010，26（1）：24－26．

Influence of Rhodiola Rosea Oral Liquid on the Hypoxia Tolerance of Rat Myocardial Cell

Yao Zhuoxian,Feng Kai
(Changzhou First People′s Hospital,Changzhou,Jiangsu,China 213001)

Objective To investigate the improvement of hypoxia tolerance of rat myocardial cells by Rhodiola rosea Oral Liquid．M ethods 40 male SD neonate rats were randomly distributed into 4 groups by their weights:solvent control group,model group,positive control group and the experimental group．The solvent group and the model group were treated with physiological saline(20 μL／mL), while the positive control group was treated with physiological saline capsule(20 μg／mL)and the experimental group with oral liquid of Rhodiola rosea(20 μL／mL)．The rat myocardial cells were cultured for 10 d in DMEM medium without fetal bovine serum．The solvent control group was cultured in incubator with normal conditions．The model group,positive control group and the experimental group were cultured in tri－gas incubat with 5% CO2and 1% O2at 37℃ for 6 h．Afterward,cell culture supernatant was harvested and analyzed through a number of assays．Based on the kit instruction,the levels of lactate dehydrogenase,malonaldehyde,creatine kinase,superoxide dismutase were subsequently measured．The rest cells were collected．The apoptosis of these cells was observed based on the Keki cell apoptosis detection kit instruction by flow cytometry,while the activity of these cardiac muscle cells was measured with the method of MTT．Results The whole experiment indicates that Rhodiola rosea Oral Liquid significantly increased the cell viability and reduced the cell death of rat primary cultured myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．The assay performed indicated that the oral liquid of Rhodiola rosea lowered the myocardial enzymes level,which were induced by myocardial cell hypoxia and the levels of free radicals,showing that there was a better protective effect on hypoxic myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．Conclusion Rhodiola rosea Oral Liquid can obviously improve the hypoxia tolerance of rat myocardial cells,and provide experimental data for the clinical treatment of hypoxic cardiomyopathy．

Rhodiola rosea Oral Liquid;rat;myocardial cells;hypoxia;tolerance

R285．5；R286

A

1006－4931(2016)09－0038－03

2015－10－14)