楊 欣，董博宇

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

清開靈霧化吸入對大鼠口、鼻、氣管及肺的刺激作用研究

楊 欣，董博宇

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 研究清開靈霧化吸入對SD大鼠的口、鼻、氣管及肺泡的刺激性。方法 將12只大鼠隨機(jī)分為對照組（予生理鹽水），清開靈低濃度組（1∶10）和清開靈高濃度組（1∶1），進(jìn)行為期7 d的霧化吸入試驗，每次給藥后觀察大鼠的行為活動變化。第8天取口腔黏膜、鼻中隔黏膜、氣管、左肺，制備石蠟切片，觀察形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行右肺泡灌洗，測定灌洗液蛋白分泌量和乳酸脫氫酶(LDH)活力。結(jié)果 切片顯示高、低濃度給藥組大鼠的口、鼻、氣管及肺泡的切片均有明顯損傷，且高濃度組損傷顯著高于低濃度組；各組肺泡灌洗液中BCA蛋白測定值無顯著差異；LDH活力測定結(jié)果則顯示給藥組與對照組有顯著差異，且與濃度呈正相關(guān)。結(jié)論 清開靈霧化吸入對大鼠口、鼻、氣管及肺泡有刺激性，且高濃度霧化時會造成較大的呼吸道黏膜組織損傷。

清開靈；霧化吸入；病理切片；肺泡灌洗；刺激性

霧化吸入作為臨床常見的給藥方式，是指藥物以特殊裝置給藥，經(jīng)呼吸道腔道、黏膜等發(fā)揮全身或局部作用的一種給藥方式，具有藥物能直接到達(dá)作用部位、可避免肝臟首過效應(yīng)等優(yōu)勢[1]。目前，已有包括用于肺部和呼吸道局部治療至少50多個西藥配方霧化劑批準(zhǔn)生產(chǎn)，尚沒有獲得批準(zhǔn)的中藥霧化吸入制劑。

清開靈方中金銀花、梔子、板藍(lán)根、黃芩和人工牛黃含抗菌、抗病毒作用的有效成分，并有較強(qiáng)的退熱及免疫調(diào)節(jié)作用[2]，因此臨床常用于清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神，治療外感風(fēng)熱時毒、火毒內(nèi)盛所致的高熱不退、煩躁不安、咽喉腫痛、急性咽炎、急性氣管炎。許多基層醫(yī)生認(rèn)為，清開靈霧化吸入可使藥液以微粒的形式直接作用于口腔及呼吸道黏膜，作用范圍集中、濃度大、效果快[3]，因此清開靈霧化給藥成為許多基層醫(yī)生常用的給藥方式。然而清開靈的霧化吸入給藥方式尚未得到有關(guān)部門批準(zhǔn)，也不是通過審批的新藥，缺乏安全性研究數(shù)據(jù)。筆者根據(jù)本實驗室前期對黏膜刺激性的研究[4－5]，以大鼠為模型評價清開靈霧化給藥的刺激性，現(xiàn)報道如下。

1 動物、材料與方法

1．1 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重250～300 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號為SDXK＜京＞2012－0001。

1．2 試藥

清開靈注射液（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z13020880，批號為 130520C1，規(guī)格為每支 10 mL）；0．9%氯化鈉注射液（生理鹽水，北京化工廠，批號為20130606）；10%中性福爾馬林固定液（北京博奧拓科技有限公司）；HE染料（北京斯百匯生物科技有限責(zé)任公司）；石蠟（上海鼎杰生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1．3 儀器

霧化裝置（自制）；LEICA 300型脫水機(jī)，LEICA EG1150H型包埋機(jī)，LEICA HI1210型展片機(jī)，LEICA RM2255型切片機(jī)，LEICA HI1220型烤片機(jī)；CX21型顯微鏡（日本OLYMPUS）；易創(chuàng)顯微圖像處理軟件－MIE V2．0（山東易創(chuàng)電子有限公司）；403M型壓縮空氣式霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；CT15RT型臺式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備有限公司）；Multiskan Go型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）、96孔板（美國Corning Incorporated公司）BCA蛋白定量試劑盒（中國Biomiga公司）；乳酸脫氫酶(LDH)活力定量測定試劑盒E1020（普利萊基因技術(shù)有限公司）；手術(shù)剪、眼科鑷等。

1．4 方法

分組及給藥：將12只大鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，分別為低濃度清開靈組、高濃度清開靈組和對照組，給藥組采用清開靈注射液與生理鹽水比為1∶1（高濃度，與臨床報道濃度一致）和1∶10（低濃度）的清開靈霧化劑，對照組給予生理鹽水，霧化吸入，每次20 min，每天2次，連續(xù)給藥7 d。每次給藥后觀察并記錄大鼠呼吸頻率、幅度及活動狀態(tài)。

動物解剖：給藥第8天對3組大鼠進(jìn)行解剖，觀察鼻腔、氣管等部位有無出血和水腫，兩側(cè)肺表面有無出血、感染、肺實變或肺氣腫現(xiàn)象；觀察并記錄肺、心、肝、脾、腎、大腸及小腸等部位的體積大小、色澤、位置、硬度、積水、淤血等情況。

空間自相關(guān)分析基于相關(guān)指標(biāo)來測度要素在空間分布上是否呈現(xiàn)聚集性從全域空間自相關(guān)、局部空間自相關(guān)兩個方面進(jìn)行分析。

切片及肺泡灌洗：將左側(cè)一片肺葉結(jié)扎并取下，再取氣管、鼻中隔、口腔黏膜，分別放入福爾馬林溶液中浸泡，制作HE染色切片。將注射器針頭插入氣管，細(xì)線結(jié)扎，向右肺緩慢注入生理鹽水2．5 mL，停留0．5 min后緩慢抽出，反復(fù)2次，收集灌洗液。計算回收率，將灌洗液加入離心管中，1 500 r／min，離心15 min，直接測定。灌洗液進(jìn)行BCA法測定總蛋白濃度、LDH活力測定。

2 結(jié)果

2．1 觀察結(jié)果

試驗階段前期3組大鼠的順應(yīng)性較差，有抵抗情緒，給藥后精神興奮；試驗階段后期各組大鼠抵抗減弱，順應(yīng)性良好。對照組少數(shù)大鼠有眼睛和鼻腔出血現(xiàn)象，低濃度清開靈組和高濃度清開靈組的部分大鼠有眼睛和鼻腔出血現(xiàn)象，高濃度清開靈組相對嚴(yán)重。

2．2 切片結(jié)果

分別做3組大鼠的4個部位組織切片。

圖1顯示，對照組鼻中隔黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，柱狀纖毛完好；給藥組上皮細(xì)胞增生，柱狀上皮轉(zhuǎn)化成鱗狀上皮，纖毛損傷、脫落，且伴有輕微出血現(xiàn)象，病變明顯。

圖2顯示，對照組肺部肺泡壁薄而完整，無出血現(xiàn)象，肺泡大小適中、均勻；低濃度清開靈組肺泡壁明顯增厚，某些部位肺泡結(jié)構(gòu)不明顯，間質(zhì)炎癥明顯并有輕度肺炎；肺泡內(nèi)有血細(xì)胞，有肺出血現(xiàn)象；高濃度清開靈照組肺泡壁聚集，且肺泡結(jié)構(gòu)更加不明顯，支氣管中有分泌物存在，損傷程度大于低濃度清開靈組。

圖4顯示，對照組氣管結(jié)構(gòu)清晰，黑色部分為軟骨，白色部分為脂肪，上皮細(xì)胞排列整齊，有柱狀纖毛；低濃度清開靈組纖毛結(jié)構(gòu)有損傷；高濃度清開靈組還觀察到有出血、壞死情況，上皮組織脫落，損傷嚴(yán)重，證明有氣管炎癥。

圖1 鼻中隔黏膜病理切片

圖2 肺部病理切片

圖3 口腔黏膜病理切片

圖4 氣管病理切片

2．3 肺泡灌洗結(jié)果

2．3．1 灌洗液回收率

各組平均回收率可達(dá)到80%以上，基本滿足測定需要。見表1。

表1 肺泡灌洗液回收率結(jié)果(s，%，n＝4)

表1 肺泡灌洗液回收率結(jié)果(s，%，n＝4)

組別對照組低濃度清開靈組高濃度清開靈組第1次83±2．6 81±0 82±0．7第2次79±2．6 81±0 81±0．7平均回收率81．0±2．6 81±0 81．5±0．7

2．3．2 BCA試劑盒和LDH試劑盒測試結(jié)果

以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，灌洗液蛋白（μg／mL）為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝0．001 1 X－0．007 8（X范圍在0～381 μg／mL），r＝0．998 8。結(jié)果表明，灌洗液蛋白濃度在0～381 μg／mL線性關(guān)系良好。見圖5。

圖5 灌洗液蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，LDH活力單位為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 Y＝0．000 2 X－0．005（X范圍在0～240 1），r＝0．998 8。結(jié)果表明LDH活力單位在0～240 1線性關(guān)系良好。見圖6。

圖6 灌洗液LDH活力單位曲線

2．3．3 灌洗液測定結(jié)果

BCA蛋白測定結(jié)果通過統(tǒng)計分析，給藥組與對照組無顯著性差異，表示蛋白濃度相差不大。LDH活力測定結(jié)果通過統(tǒng)計分析，給藥組與對照組均有顯著差異（P＜0．05），且高濃度顯著高于低濃度組。見表2。

表2 灌洗液測定結(jié)果(s，n＝4)

表2 灌洗液測定結(jié)果(s，n＝4)

注：與對照組比較， P＜0．05；與低濃度清開靈組比較，P＜0．05。

組別對照組低濃度清開靈組高濃度清開靈組蛋白濃度（ g／mL）183．42±17．86 163．15±23．21 223．70±63．16 LDH活力單位24．08±31．53 159．50±78．61 1 479．99±63．16

3 討論

清開靈注射液臨床運(yùn)用廣泛，然而清開靈霧化吸入給藥屬于超說明書用藥，需要重點(diǎn)監(jiān)控。本試驗結(jié)果顯示，霧化吸入給藥過程中觀察到大鼠的眼睛、鼻腔出現(xiàn)不同程度出血，通過切片分析直觀表現(xiàn)出大鼠口腔、鼻腔、肺部及氣管有出血和損傷，高濃度清開靈組受損程度高于低濃度清開靈組。BCA蛋白測定無顯著性差異，BCA是通過蛋白質(zhì)將CU2＋還原成CU＋再與BCA試劑反應(yīng)，根據(jù)吸光度值來顯示蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果顯示肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)含量無明顯變化。LDH蛋白測定有顯著差異（P＜0．05)，表示大鼠的肺中存在炎癥，有多種組織損傷，患有肺炎，高濃度清開靈濃度組LDH含量高于低濃度清開靈濃度組，說明清開靈霧化劑對大鼠的口、鼻、氣管及肺有一定刺激性，會造成口、鼻、氣管及肺組織損傷，且隨著清開靈霧化劑濃度的增加，對大鼠相關(guān)組織的刺激程度變強(qiáng)。

本研究結(jié)果表明，盡管已有大量的研究表明清開靈霧化劑可起到較好的化痰、消炎功效，并起到抗菌、抑制口腔致病菌、清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神等作用，但其對鼻腔、口腔、肺及氣管刺激性大，帶來的損傷不容忽視，在臨床用藥中應(yīng)引起高度重視。

[1]張文乾．清開靈霧化吸入治療慢性阻塞性肺病急性加重期36例[J]．吉林醫(yī)學(xué)，2010，31(9):1 215．

[2]趙柏慶，林秀云，張遠(yuǎn)榮，等．清開靈注射液霧化吸入聯(lián)合抗生素治療吸入性肺炎療效觀察[J]．新中醫(yī)，2014，46(10): 52－54．

[3]張 紅．清開靈霧化吸入防治鼻咽癌放療后急性口腔黏膜反應(yīng)的臨床觀察[J]．中國中醫(yī)藥科技，2008，15(6):468－470．

[4]程艷珂，郭懿望，尚可心，等．以溶解度與刺激性為指標(biāo)篩選葛根素滴鼻液溶劑及增溶劑[J]．中國中藥雜志，2014(22): 4 335－4 339．

[5]Wen R，Li HY，Du SY，et al．Preparation of mPEG 2000－PLA－modi?ed Xingnaojing microemulsion and evaluation in mucosal irritation[J]．JournalofBiomaterialsScience，2014，25(9): 923－942．

Stimulation of Qingkailing Inhalation on Rats′M outh,Nose,Trachea and Lung

Yang Xin,Dong Boyu
(School of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China 100102)

Objective To study the stimulation effect of Qingkailing Inhalation on SD rats′mouth,nose,trachea and lung．M ethods 12 Wistar rats were randomly divided into 3 groups,namely the control group(saline),Qingkailing low concentration group(1∶10)and Qingkailing high concentration group(1∶1),for a 7 d atomization inhalation experiment and the behavior of rats after each administration was observed．On the 8th day,the oral mucosa,nasal septum mucosa,trachea,left lung,paraffin sections were prepared to observe the structural changes of the morphology．The right alveolar lavage was performed at the 8th day,and the lavage fluid protein and LDH activity were measured．Results There was an obvious damage in the mouth,nose,trachea and lung in the high and low concentration groups,and the damage in the high concentration group was significantly higher than that in low concentration group．There was no significant difference between the BCA protein in the bronchoalveolar lavage fluid in the 3 groups．LDH activity assay showed significant differences between the two Qingkailing groups and the control group,and showed a positive correlation．Conclusion Qingkailing atomization inhalation has stimulation effect on rats′mouth,nose,trachea and lung,and high concentration of atomization can cause huge tissue damage of the respiratory mucosa．

Qingkailing;inhalation;pathological section;alveolar lavage;stimulation

R285．5；R286

A

1006－4931(2016)09－0018－04

楊欣，女，大學(xué)本科，主要從事中藥研究，（電子信箱）810210331＠qq．com。

2015－10－14)