葉少劍, 曾 媛, 寧明敏, 王煜晨, 陳曉清, 李慧霞, 冷碧清, 楊鑫壁, 翁小, 胡嘉英, 朱澤琪, 方 宇

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430056)

間斷性屈膝缺血預(yù)適應(yīng)對小鼠缺氧耐力的影響*

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430056)

目的：觀察和比較兩種后肢缺血法產(chǎn)生的缺血預(yù)適應(yīng)對小鼠耐受缺氧能力的影響。方法：昆明小鼠96只，分成對照組、間斷屈膝固定組(KF)或束縛大腿組(TT)進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)。每天預(yù)適應(yīng)1次，7 d后各組小鼠再分為3組分別進(jìn)行常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒實驗和斷頭后心、腦耐缺血實驗。結(jié)果：兩種后肢缺血法小鼠常壓耐缺氧時間均顯著延長(P<0.01)，斷頭后張口呼吸時間顯著高于對照組(P<0.05)。但對亞硝酸鈉中毒生存時間和心臟跳動時間沒有明顯影響。結(jié)論：肢體缺血預(yù)適應(yīng)能顯著增強小鼠缺氧耐力。

肢體缺血預(yù)適應(yīng)；耐缺氧；小鼠

limb ischemia preconocition; hypoxia tolerance; mice

缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning)指預(yù)先對某組織或器官反復(fù)實施短期缺血再灌注后，在隨后經(jīng)歷較長時間缺血并復(fù)灌后，其損傷程度顯著減輕的現(xiàn)象[1]。近年來提出的遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic preconditioning,RIPC)理論[2]，認(rèn)為在整體動物實施某部位缺血預(yù)適應(yīng)時，這種保護作用實際上是全身性的反應(yīng)，也即不僅被實施缺血的部位能得到保護，身體其他的器官同樣能產(chǎn)生對長期缺血的保護作用。因此通過四肢等容易實施的部位進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)，為心、腦、腎等重要器官預(yù)防性缺血保護作用提供了可能。通常使用的方法是采用止血帶或血壓帶束縛上肢或下肢阻斷血流5 min后恢復(fù)血流5 min作為一個循環(huán)，一次連續(xù)進(jìn)行3～4個循環(huán)即為實施一次缺血預(yù)適應(yīng)[3]。人類取跪坐姿勢時可以造成月國動脈血流嚴(yán)重減少甚至阻斷，間斷進(jìn)行應(yīng)該也可以起到缺血預(yù)適應(yīng)效果。間斷屈膝法阻斷小鼠后肢血流可以模擬人體的跪坐法缺血預(yù)適應(yīng)。整體小鼠耐缺氧試驗可用于觀察機體對于缺氧環(huán)境的承受能力，能綜合反映心腦肺等重要生命器官功能的變化。本實驗通過兩種不同方法造成后肢缺血，觀察其對耐缺氧能力的影響，比較兩種缺血方法的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物成年雄性昆明種小鼠，體重35～40 g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(動物合格證號42009800001335)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 在缺血預(yù)適應(yīng)階段將96只小鼠隨機分成3組(n=32)：即對照組、束縛大腿組和屈膝固定組；預(yù)適應(yīng)后再將每組小鼠分成3種不同處理組：即常壓耐缺氧組(n=14)，亞硝酸鈉組和心腦缺血耐受組(n=9)。

1.2.2 小鼠后肢缺血預(yù)適應(yīng) 采用兩種方法使后肢缺血實施預(yù)適應(yīng)，每天1次，共7 d。束縛大腿組：以粗棉線纏繞一側(cè)大腿中部兩圈后用止血鉗夾緊，強度能阻斷股動脈血流(足背動脈無搏動)，5 min后放松棉線讓小鼠活動5 min，重復(fù)2次，共計30 min完成一次預(yù)適應(yīng)；屈膝固定組：將小鼠一側(cè)膝關(guān)節(jié)彎曲使大腿小腿緊緊相貼(阻斷月國動脈血流)，并用粗棉線纏繞后止血鉗固定使不會松開即可，5 min后松開棉線讓小鼠活動5 min，重復(fù)2次為1次預(yù)適應(yīng)。兩種缺血法均在左右后腿交叉進(jìn)行。對照組小鼠以限制活動代替阻斷血流過程。

1.2.3 常壓耐缺氧試驗 將小鼠放入內(nèi)置20 g鈉石灰和濾紙的250 ml廣口瓶中，瓶蓋涂以凡士林防止漏氣。計時廣口瓶密閉至小鼠呼吸停止所需的時間為常壓耐缺氧時間。

1.2.4 亞硝酸鈉中毒試驗 以240 mg/kg 劑量腹腔注射亞硝酸鈉溶液，計時注射至小鼠死亡時間。

1.2.5 斷頭后心、腦耐缺血時間 參照文獻(xiàn)方法[4]，用剪刀將小鼠自耳后迅速斷頭，觀察并計時鼠頭張口呼吸時間；剪開胸腔暴露心臟，觀察左心室繼續(xù)有規(guī)律跳動持續(xù)時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 常壓耐缺氧試驗

與對照組相比，束縛大腿組和屈膝固定組小鼠的常壓耐缺氧時間均顯著延長(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Effects of limb RIPC on hypoxia tolerance(HT) in mice(n=14, ±sD)

GroupBodyweight(g)TimeofHT(min)Control42．9±2．1920．9±2．74TT41．9±3．5825．2±3．66??KF41．2±2．2124．7±3．53??

TT: Tightening thigh； KF: Knee flexion; RIPC: Remote ischemic proconditioning

**P<0.01vscontrol group

2.2 亞硝酸鈉中毒試驗

亞硝酸鈉腹腔注射后，束縛大腿組、屈膝固定組的小鼠中毒致死時間與對照組結(jié)果相似，差異無顯著意義(表2)。

Tab. 2 Effects of limb RIPC on sodium nitrite toxication in mice(n=9, ±s)

GroupBodyweight(g)Timeofdeath(min)Control42．8±2．8516．5±3．37TT41．3±2．8615．5±1．69KF42．0±2．7416．6±3．63

TT: Tightening thigh； KF: Knee flexion; RIPC: Remote ischemia preconditioning

2.3 斷頭后張口呼吸時間及心室跳動時間

與對照組比較，束縛大腿組、屈膝固定組的張口呼吸時間均明顯延長(P<0.05)，而兩組心室跳動時間無明顯差異(表3)。

Tab. 3 Effects of limb RIPC on cardiac and cerebral ischemia tolerance in mice(n=9, ±sD)

GroupTimeofbreathing(Sec)Timeofheartrate(min)Control15．2±2．577．1±3．45TT18．2±5．20?7．6±3．90KF18．4±3．33?6．5±4．15

TT: Tightening thigh; KF: Knee flexion; RIPC: Remote ischemia proconditioning

*P<0.05vscontrol

3 討論

肢體缺血預(yù)適應(yīng)對四肢進(jìn)行反復(fù)短期缺血再灌，繼而引起全身性保護作用，這種現(xiàn)象已經(jīng)在多個單獨器官被觀察到[2,3]。但是對于機體整體功能影響的實驗報道并不多見。理論上講，缺血預(yù)適應(yīng)使多個器官缺血耐受力的增強也應(yīng)該表現(xiàn)為整體動物對缺氧耐受力的增強，而本文的常壓耐缺氧實驗結(jié)果證明了這一點。斷頭后小鼠張口呼吸時間在兩個缺血預(yù)適應(yīng)組也明顯延長，表明經(jīng)過7 d的肢體缺血再灌注，大腦已經(jīng)增強了耐缺氧能力。婁建石等[5]采用大鼠后肢缺血預(yù)適應(yīng)，3 d后即觀察到缺血再灌注后大鼠心肌梗死面積顯著縮小，但是本實驗在單純觀察小鼠心臟缺血后跳動時間時各組差別并不大，表明觀察心臟功能時不同指標(biāo)的表現(xiàn)可能不盡相同。有待利用大鼠心肌缺血再灌注損傷實驗進(jìn)一步驗證。

本實驗比較了直接束縛小鼠大腿中部阻斷股動脈和屈膝固定阻斷月國動脈兩種方法造成的缺血預(yù)適應(yīng)效果，發(fā)現(xiàn)兩組之間結(jié)果無顯著差異，表明兩種方法造成的預(yù)適應(yīng)效果相似。研究發(fā)現(xiàn)人類某些姿勢可以導(dǎo)致局部血管受壓后組織缺血，如打坐[6]或跪坐姿勢。日本學(xué)者報道[7]人跪坐時月國動脈受壓可達(dá)200 mmHg以上，足以引起動脈閉塞下肢缺血，長期跪坐不動甚至?xí)鹣轮∪馊毖獕乃?。如果合理使用跪坐，比如間斷跪坐法[8]，就可以達(dá)到缺血預(yù)適應(yīng)的效果而避免嚴(yán)重的副作用。本實驗間斷屈膝法操作結(jié)束后小鼠后肢結(jié)構(gòu)和運動功能沒有產(chǎn)生可見影響。

肢體缺血預(yù)適應(yīng)具有無創(chuàng)安全有效的特點。與使用血壓帶等阻斷血流相比，間斷跪坐法不需要特別設(shè)備，且方法簡單容易操作。本實驗表明，間斷屈膝固定可以產(chǎn)生和束縛大腿一樣的效果，推測在人體進(jìn)行間斷性跪坐應(yīng)該能產(chǎn)生類似的作用。在運動性心腦血管意外預(yù)防、高海拔低氧反應(yīng)防治和深度潛水及其他可能導(dǎo)致機體嚴(yán)重缺血缺氧性損傷的情形下，采用間斷性跪坐法進(jìn)行預(yù)適應(yīng)，有可能明顯降低這些危害的發(fā)生率，或減輕發(fā)生后的嚴(yán)重程度，具有實際應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步研究。

[1] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation, 1986, 74(5): 1124-1136.

[2] Gho BC, Schoemaker RG, van den Doel MA,etal. Myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue[J].Circulation, 1996, 94(9): 2193-2200.

[3] Kharbanda RK, Mortensen UM, White PA,etal. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo[J].Circulation, 2002, 106(23): 2881-2883.

[4] 賀 敏， 丁雪潔， 李偉靜， 等. 黑青稞籽皮提取物提高小鼠耐缺氧及抗疲勞能力的初步研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2014, 11(28): 7-10.

[5] 高建波， 張 穎， 婁建石. 無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠缺血再灌注損傷心肌持續(xù)保護效應(yīng)[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(9)： 1691-1695.

[6] 葉少劍. 打坐健身機制新探[J]. 醫(yī)學(xué)與哲學(xué), 2014, 35(11B)： 75-77.

[7] Demura S, Uchiyama M. Effect of Japanese Sitting Style (Seiza) on the Center of Foot Pressure after Standing[J].PhysiolAnthropolApplHumanSci, 2005, 24(2): 167-173.

[8] 葉少劍. 間斷性跪坐對猝死的防治作用探討[J]. 健康必讀, 2015, (6下): 26.

2015-12-28

2016-05-19

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A ?

1000-6834(2016)05-412-02

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.007

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