程杰坤， 孫小慧， 高莉萍， 李 樂

(浙江工業(yè)大學藥學院， 杭州 310014)

法舒地爾對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚的干預作用及其機制*

程杰坤， 孫小慧， 高莉萍， 李 樂△

(浙江工業(yè)大學藥學院， 杭州 310014)

目的：研究法舒地爾對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚的影響及其機制。方法：除正常對照組外，其它SD大鼠均皮下注射異丙腎上腺素(Iso，5 mg/kg)建立心肌肥厚模型。大鼠隨機分為4組：正常對照組、Iso模型組、法舒地爾低劑量組(Fas，5 mg/kg，i.p)和法舒地爾高劑量組(Fas，20 mg/kg，i.p)，連續(xù)給藥8周。給藥結束后，血流動力學檢測大鼠心率(HR)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室末舒張壓(LVEDP)和左室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)；分別測定大鼠體重(BW)，心臟重量(HW)，并計算HW/BW；大鼠心肌HE、Masson染色觀察組織病理學改變；免疫組化法觀察大鼠心肌組織ERK1、ERK2蛋白表達，RT-PCR觀察ERK1、ERK2 mRNA的表達。結果：Iso模型組HR和LVEDP明顯升高，LVSP和±dp/dtmax明顯下降；HW/BW增大；心肌細胞體積變大，排列紊亂，膠原纖維增生；左心室組織ERK1、ERK2蛋白與mRNA表達上調。法舒地爾不同劑量干預后，心臟收縮和舒張能力得到改善，心指數(shù)明顯下降，心肌細胞體積變小，纖維化減少，ERK1/2 mRNA表達下調，心肌組織損害均得到不同程度改善。結論：ERK1/2信號通路活化參與了異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚，法舒地爾對異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚具有明顯改善作用，這可能與法舒地爾阻斷ERK1、ERK2通路活化有關。

異丙腎上腺素；ERK1/2；法舒地爾；心肌肥厚；大鼠

心肌肥厚(cardiac hypertrophy，CH)是心血管疾病的一種常見的并發(fā)癥，是心肌細胞對多種病理刺激的一種長期慢性反應,已被列為引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素[1，2]。其發(fā)病機制主要與心肌間質纖維化、收縮功能失調以及基因表達、神經(jīng)體液代謝和心臟電生理特征異常有關[3]，最終導致失代償性心功能衰竭，嚴重危害人體健康。近年來細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERKs)在心肌肥厚的進程中備受關注，處于CH心肌肥厚調節(jié)中心位置，對心肌細胞的增生、分裂、繁殖和存活起著重要作用[4]。研究顯示，ERK信號通路與CH的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，ERK抑制劑能有效降低CH心肌細胞蛋白含量，減小心肌細胞體積[5]，但在異丙腎上腺素(isoprenaline，Iso)誘導的CH心肌肥厚中的作用并無報道。法舒地爾(fasudil，F(xiàn)as)是目前臨床唯一可用的Rho激酶抑制劑，在臨床研究中對許多心血管疾病如腦血管痙攣、高血壓、心力衰竭、肺動脈高壓、動脈粥樣硬化等已顯示了明確的療效[6],但其是否可通過影響心肌ERKs的表達抗CH尚無報道。本實驗通過Iso建立大鼠CH動物模型，觀察ERK1/2的變化及Fas對大鼠CH的作用和ERK1/2表達的影響，初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸Fas注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號 130406)，鹽酸Iso注射液(上海禾豐制藥有限公司，20121005)，總RNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(杭州博日科技有限公司)，熒光PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，MPA心功能分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，NIS-Elements尼康圖像處理軟件(日本尼康公司)，Synergy H1多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，熒光定量PCR分析儀(美國ABI公司)，Image Lab5.0成像分析系統(tǒng)(美國伯樂BIO-RAD公司)。

1.2 實驗動物

健康SD大鼠，雌雄各半，共40只，體重180～200 g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于浙江工業(yè)大學藥學院動物實驗室，飼養(yǎng)條件為恒溫(22±2)℃，相對濕度40%～70%，飼養(yǎng)條件符合實驗動物環(huán)境設施要求。實驗前適應性喂養(yǎng)1周，試驗期間自由飲食。

1.3 造模及給藥

將40只SD大鼠隨機分為4組(n=10)：正常對照組、模型組、低劑量給藥組、高劑量給藥組。模型組給藥Iso 5 mg/(kg·d)(s.c)；低劑量給藥組Iso 5 mg/(kg·d)(s.c)+ Fas 5 mg/(kg·d)(i.p)；高劑量給藥組Iso 5 mg/(kg·d)(s.c)+ Fas 20 mg/(kg·d)(i.p)；正常對照組，每天給予和模型組等劑量的生理鹽水，給生理鹽水和給藥均持續(xù)8周(s.c：皮下注射，i.p：腹腔注射)。

1.4 血流動力學指標檢測

各組大鼠停藥24 h，禁食12 h后稱量體重(body weight，BW)，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)i.p麻醉，仰臥固定，于頸部行剪開縱行切口，分離右頸總動脈，將導管從右頸總動脈緩慢插至左心室，待波形圖穩(wěn)定10 min后，測量大鼠心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressuer，LVSP)、左心室末舒張壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 心臟重量指數(shù)測定

放血處死大鼠，開胸取出心臟，于4℃生理鹽水中清洗，取出用濾紙吸干鹽水和血污，放置電子天平上稱量心臟重量(heart weight，HW)，測量心臟肥厚程度和心臟重量指數(shù)(HW/BW)。

1.6 心肌組織病理學檢查及免疫組化分析

取左心室組織，于10%甲醛固定，酒精梯度洗脫，常規(guī)包埋，經(jīng)HE染色，Masson染色觀察組織病理學改變，免疫組化法檢測ERK1/2蛋白的表達：在400倍高倍顯微鏡下，隨機選取組織結構保存較好的心肌組織，用Image Pro plus 6.0軟件分析，計算平均光密度值。每張圖片平均光密度的計算方法為視野陽性染色的積分光密度除以圖片的總面積，取6張圖片的平均值為該切片的結果。

1.7 RT-PCR法觀察ERK1、ERK2 mRNA的表達

取心肌組織，總RNA提取試劑盒提取總RNA，酶標儀測量其濃度并檢測其純度(均在1.8～2.2之間)。取1 μg總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，再取2 μl cDNA進行PCR擴增。ERK1上游引物為5’-ACACTGGCTTTCTGACCGAG-3’，下游引物為5’-CCGGTTGGAGAGCATCTCAG-3’，產(chǎn)物大小為137 bp；ERK2上游引物為5’-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3’，下游引物為5’-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC-3’，產(chǎn)物大小為136 bp。RT-PCT循環(huán)條件：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s形成熔點曲線。取各擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳, Image Lab成像分析系統(tǒng)對目的基因進行分析, 以平均灰度值/β-actin的平均灰度值,代表相應基因mRNA的表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

Iso造模后各組大鼠未出現(xiàn)呼吸困難、水腫、進食困難和少尿等心衰癥狀，F(xiàn)as干預后未見大鼠死亡，8周后處理大鼠，模型組大鼠心臟異常增大，左心室肥厚明顯，給藥組大鼠心臟肥厚癥狀明顯緩解。

2.2 血流動力學指標測定

與正常對照組比較，Iso模型組HR和LVEDP明顯升高(P<0.05，P<0.01),而LVSP和±dp/dtmax明顯下降(P<0.01)。與Iso模型組對比，F(xiàn)as低劑量組LVSP明顯升高(P<0.05)；Fas高劑量組HR和LVEDP明顯下降(P<0.05)，LVSP和±dp/dtmax明顯升高(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Hemodynamics of the cardiac hypertrophy rats(±s，n=8)

FASL： Fasudil in low dose； FASH： Fasudil in high dose； HR： Heart rate； LVSP: Left ventricular systolic pressure； LVEDP： Left ventricular end-diastolic pressure； ±dP/dtmax： Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；?#P<0.05vsmodel

2.3 大鼠BW、HW及指數(shù)HW/BW測定

與正常對照組比較，Iso模型組HW/BW明顯升高(P<0.05)。與Iso模型組比較，F(xiàn)as低劑量組和高劑量組HW/BW明顯下降(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Index of heart weight of rats(±s，n=8)

BW: Body weight; HW: Heart weight

*P<0.05vscontrol；?#P<0.05vsmodel

2.4 大鼠心肌組織切片觀察結果

心肌組織HE染色，400倍光鏡下觀察(圖片中標尺為50 μm)。結果顯示：模型組心肌細胞與正常組比較，體積明顯增大，炎癥細胞侵潤，細胞排列紊亂；Fas低劑量給藥后與模型組比較，炎癥細胞侵潤和細胞體積有所減小；Fas高劑量給藥后與模型組比較，炎癥細胞侵潤、細胞體積明顯減小，排列整齊(圖1)。

Fig. 1 Pathological changes of myocardial tissue in rats(HE staining ×400) A： Control group； B： Model group； C： Fasudil in low dose； D： Fasudil in high dose

心肌組織Masson染色，400倍光鏡下觀察(圖片中標尺為50 μm)。模型組與正常組比較可見模型組大鼠心肌內(nèi)層及間質中可見多處大面積(圖中箭頭所示)的塊狀瘢痕組織，為膠原蛋白過度表達及心肌壞死后成纖維細胞增生所致，法舒地爾高低劑量組分別進行干預后，具有明顯的改善效果(圖2)。

Fig. 2 Expression of collagen protein in myocardium tissues of rats (Masson staining×400) A： Control group； B： Model group； C： Fasudil in low dose； D： Fasudil in high dose

與正常組比較 ,模型組大鼠心肌細胞胞漿中有較多棕黃色顆粒狀物質，呈強陽性反應，法舒地爾高低劑量組棕黃色顆粒數(shù)明顯減少，箭頭所示為ERK1蛋白的表達(圖3)。半定量分析結果顯示: 法舒地爾能有效抑制ERK1蛋白的表達(P<0.01)，且Fas高劑量抑制ERK1蛋白表達效果更明顯(表3)。

Fig. 3 Expression of ERK1 in myocardium tissues of rats (immunohistochemical staining ×400) A： Control group； B： Model group； C： Fasudil in low dose； D： Fasudil in high dose； ERK: Extracellular signal-regulator lcinases

與正常組比較，Iso模型組ERK2蛋白(箭頭所示為ERK2蛋白的表達)明顯增多，F(xiàn)as高低劑量干預后，ERK2蛋白表達量顯著下調(圖4)。半定量分析結果顯示: 法舒地爾明顯抑制ERK2蛋白的表達(P<0.01)，F(xiàn)as高劑量抑制效果更明顯(表3)。

Fig. 4 Expression of ERK2 in myocardium tissues of rats (immunohistochemical staining ×400) A： Control group； B： Model group； C： Fasudil in low dose； D： Fasudil in high dose

Tab. 3 Expression of ERK1/2 protein in myocardium tissues of rats (±s，n=6)

GroupERK1ERK2 Control0．11±0．050．13±0．06Model0．44±0．12??0．45±0．14??FASL0．18±0．09##0．19±0．07##FASH0．17±0．06##0．17±0．09##

**P<0.01vscontrol；?##P<0.01vsmodel

2.5 ERK1/2 mRNA RT-PCR結果

ERK1/2的亮度值以β-actin亮度為基準進行統(tǒng)計，與正常對照組比較，Iso模型組ERK1/2 mRNA表達上調(P<0.01)，與Iso模型組比較，F(xiàn)as低劑量組和Fas高劑量組ERK1/2mRNA表達下調(P<0.05，P<0.01)，且Fas高劑量組中下降更加明顯(圖5，表4)。

Fig. 5 Expression of ERK1/2 mRNA in myocardium tissues of rts

Tab. 4 Expression of ERK1/2 mRNA in myocardium tissues of rats(±s，n=6)

GroupERK1/β?actinERK2/β?actinControl0．52±0．070．55±0．06Model0．78±0．11??0．81±0．14??FASL0．63±0．08#0．71±0．07#FASH0．57±0．09##0．62±0．05##

**P<0.01vscontrol；?#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3 討論

本實驗研究觀察,連續(xù)8周進行大鼠皮下注射Iso，大鼠心臟重量指數(shù)上升，HE染色及Masson染色顯示CH、細胞形態(tài)變化、細胞體積大小和心肌纖維化等心臟重構活動，與以往的文獻報道[7，8]相吻合，表明CH造模成功。在使用Fas進行干預治療后，有效降低大鼠心臟重量指數(shù)，并有效抑制CH、細胞排列紊亂、壞死和心肌纖維化，表明Fas對Iso誘導的大鼠CH和心肌纖維化具有一定的保護作用。

ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)系統(tǒng)超家族成員中重要的酪氨酸-蘇氨酸信號調節(jié)激酶，在某些細胞外刺激及生長因子誘導下，酪氨酸蛋白激酶受體激活，導致Ras/Raf/MAPK/MEK及其下游分子激活，在這一通路中，ERK1/2激活起著重要作用[9]，有研究顯示在血管緊張素II(AngII)誘導的肥大心肌細胞，MAPK家族中pERK1/2和p-P38、p-JNK表達明顯增強[10]，因此抑制ERK1/2活化阻斷MAPK的磷酸化，從而對細胞的增殖與遷移等活動起著重要的調節(jié)作用；同時，ERK1/2激活會誘導下游轉錄因子GATA-4因子的活化，GATA-4在心肌分化增殖和存活及CH過程中起重要作用，因此抑制ERK1/2活性間接對GATA-4進行阻斷也會對CH具有改善作用[11]。近期研究表明[12]，主要存在于肌細胞中的框架蛋白分子mAKAPβ，在AngII誘導下錨定激活下游效應蛋白ERK，進而導致心肌細胞肥大，綜上可見，ERK在多條信號通路的激活與作用中均扮演重要角色，抑制ERK活性，可對心肌肥大的改善產(chǎn)生巨大影響。實驗表明，Iso模型組中ERK1/2活化和表達量明顯高于正常組，使用Fas干預后ERK1/2表達量明顯下調。ERK于細胞質中激活，但需要轉運到細胞核中才能發(fā)揮作用。近期，有研究表明[13]，ERK轉運至細胞核進行有絲分裂活動需依靠ROCK的激活，并且轉運因子Elk-1的激活需由ROCK和ERK共同來完成，這提示ROCK的激活對ERK1/2激活并轉入細胞核發(fā)揮作用有重要影響。

此外，ERK1/2對細胞增生、分裂、繁殖和存活等活動具有重要的生物學功能，在各種疾病研究中扮演著不可或缺的角色[14]。特別在心肌疾病中，ERK1/2被證實參與RhoA/ROCK信號通路下游基因表達調控[15]。他汀類藥物對ERK1/2誘導的CH的治療效果和機制尚未闡明，部分研究者表明他汀類藥物能夠激活ERK1/2，并在此基礎上對心肌梗死進行改善治療，另一些學者則表明他汀類藥物對ERK1/2為抑制效應[16-18]。我們的實驗表明，Rho激酶抑制劑Fas干預后ERK1/2表達明顯下調，這與相關文獻報道[19，20]結果一致。上述研究結果不僅表明了ERK1/2可能為RhoA/ROCK信號通路的下游作用底物，并且證明了Fas能夠抑制ERK1/2的表達，從而對ERK1/2信號激活誘導CH具有改善和治療效果。

有文獻報道[21]，ERK1/2的激活在調節(jié)心臟向心性肥大中具有重要作用。而經(jīng)Fas進行干預后，F(xiàn)as高低劑量組均能有效改善大鼠血流動力學，降低CH大鼠心臟的心指數(shù)，減小CH心肌炎癥細胞侵潤、細胞體積，改善心肌細胞排列，抑制ERK1/2蛋白的表達，下調ERK1/2 mRNA表達，且Fas高劑量組在改善上述各種指標中效果更加明顯。綜上可知：不同的Fas劑量對Iso誘導的CH的改善效果不同，F(xiàn)as高劑量能夠更好的抑制CH的發(fā)生發(fā)展，改善心臟的收縮和舒張功能，抑制心肌細胞病理變化，阻斷ERK1/2信號的傳導，能夠更有效的預防和改善心臟疾病。

Fas作為目前臨床上應用的Rho激酶抑制劑，在心血管疾病治療及新靶點的藥物開發(fā)和研究中頗具應用前景和重要意義。本文研究結果顯示，Iso誘導的CH模型中，ERK1/2的表達水平明顯上調，表明ERK1/2信號通路活化可能參與Iso誘導的CH發(fā)生發(fā)展；而Fas不同劑量干預后，ERK1/2表達明顯下調，該結果提示，F(xiàn)as對Iso誘導、ERK1/2激活參與的CH具有抑制作用，ERK1/2很可能作為RhoA/ROCK信號通路的下游作用底物而被Fas抑制，阻斷下游一系列信號通路轉導作用，抑制包括CH在內(nèi)的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。但Fas治療CH的確切機制及ERK1/2在誘發(fā)CH中的具體通路及信號通路中的相互作用關系，仍有待進一步研究闡明。

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Effects of fasudil on isoproterenol induced cardiac hypertrophy in rats

CHENG Jie-kun, SUN Xiao-hui, GAO Li-ping, LI Le△

(College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology , Hangzhou 310014, China)

Objective: To investigate the effects and mechanisms of fasudil (Fas) on cardiac hypertrophy (CH) induced by isoprenaline(Iso) in rats. Methods: Except for the normal control group, the rest three groups rats were injected subcutaneously with Iso(5 mg/kg) for setting up CH model. SD rats were randomly divided into four groups: Normal control group, Iso model group, Fas with low-dose group (5 mg/kg, i.p) and Fas with high-dose group (20 mg/kg, i.p). Animals were treated with Fas for 8 weeks. After the treatment, the following index were detected: heart rate (HR), left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP), left ventricular systolic maximum rate (+dp/dtmax) and left ventricular diastolic maximum rate (-dp/dtmax). The body weight(BW) and heart weight (HW) were weighed and heart weight index (HWI) was calculateed. Myocardial tissue specimens, HE and Masson staining were performed for observing the histopathological changes. The protein expression of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in myocardial tissue was determined by using immunohistochemical methods. The expression of ERK1/2 mRNA in the myocardial tissue was detected by using semi-quantitative RT-PCR method. Results: Compared with normal control group, HR and LVEDP were increased significantly, while LVSP and ±dp/dtmax were decreased significantly; HWI was increased significantly in CH group; The myocardial cell volume and the cell gap were increased, cells arranged disorder, and severe myocardial interstitial fibrosis was presented in CH group. The expression of ERK1/2 mRNA was significantly increased. After Fas treatment, the systolic and diastolic functions of heart were improved, cell volume was reduced, cell gap became small, cells arranged in neat rows, and the fibrosis was significantly reduced. The expressions of RhoA, ERK1/2 mRNA were significantly reduced. The damages of myocardial tissue were improved in different degrees. Conclusion: ERK1/2 signaling pathway is involved in Iso induced CH. Fas protects against the CH of rats induced by Iso, which mechanisms may be related with blocking ERK1/2 signaling pathway.

isoproterenol; ERK1/2; fasudil; myocardial hypertrophy; rats

浙江省自然科學基金資助項目(LY13H310005)；浙江工業(yè)大學藥學院華?；鹳Y助項目(2011600049/028)

2015-07-07

2016-05-12

R965.1

A

1000-6834(2016)05-414-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.008

△【通訊作者】Tel： 0571-88320535; E-mail： lile 1856@163.com