謝紅梅，孟祥宇，孫天霞，張麗軒，趙　雨，曲 毅,2*

(1.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春 130117；2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，長春 130033)

siRNA沉默胸腺素β4對鹿茸間充質(zhì)干細胞增殖的影響

謝紅梅1，孟祥宇1，孫天霞1，張麗軒1，趙雨1，曲 毅1,2*

(1.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春 130117；2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，長春 130033)

摘要：目的利用siRNA干擾技術(shù)研究胸腺素β4(Tβ4)基因沉默對鹿茸間充質(zhì)干細胞(MSC)增殖的影響。方法鹿茸MCS分為陰性對照組、siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組2組。MTT檢測MSC增殖的變化，Real-time PCR檢測ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表達量差異變化，Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化。結(jié)果siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組MSC增殖受到顯著抑制(P<0.01)；siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組ILK、CyclinD1 mRNA表達量下調(diào)，AKT mRNA表達量不變；siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組總AKT蛋白含量無變化，P-AKT蛋白含量減少。結(jié)論 Tβ4基因沉默能顯著抑制MSC增殖，并可能通過下調(diào)ILK、P-AKT及細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1從而抑制MSC細胞增殖。

關(guān)鍵詞：RNA干擾；Tβ4；間充質(zhì)干細胞；ILK/AKT信號通路

鹿茸具有強壯機體、抗衰老、增加機體免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗?jié)?、增強中樞神?jīng)系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)等藥理作用[1-4]。前期研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，在鹿茸快速生長時期，Tβ4高度表達。Tβ4是一個由43個氨基酸組成的小分子多肽，存在于大多數(shù)哺乳動物細胞中，可以促進內(nèi)皮細胞遷移、加速血管生成、降低炎癥反應(yīng)、抑制凋亡和氧化損傷。鹿茸的生長依賴于鹿茸間充質(zhì)干細胞(MSC)的增殖與分裂。本研究以MSC為模型，通過RNA干擾技術(shù)，沉默MSC的Tβ4基因，觀察MSC 增殖及ILK/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的變化，探討Tβ4沉默對MSC增殖的影響及其可能的機制，旨在為鹿茸快速生長研究探索新的途徑。

1材料

1.1主要試劑鹿茸間充質(zhì)干細胞由本實驗室保存。Tβ4小干擾RNA(siRNA-Tβ4)和CY3-陰性對照小干擾RNA均為上海吉瑪基因股份有限公司設(shè)計合成。MTT為美國Amresco公司產(chǎn)品。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品。兔來源 p-AKTser473一抗和兔來源AKT1一抗均購買于Cell Signaling公司。鼠來源Tublin一抗、兔二抗和鼠二抗均購買Abcam公司。ECL顯色劑購自碧云天公司。

1.2siRNA的合成據(jù)前期獲得的鹿茸Tβ4mRNA 序列和siRNA設(shè)計原則，鹿茸Tβ4mRNA的siRNA序列為：正義鏈GCAUAGGGCGCAUAUATT；反義鏈UAUAUGCGCGCUCCUAUGCTT；陰性對照為吉瑪公司提供的錯義siRNASCR序列。

2方法

2.1MSC細胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染MSC細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長密度達到70%～80%時，0.25%胰酶消化，離心去胰酶。并用無血清無抗性的DMEM稀釋細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104cells/L，應(yīng)用電轉(zhuǎn)法進行電轉(zhuǎn)染，siRNA濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后細胞分別接種96孔和6孔板,用于后續(xù)的細胞增殖檢測和信號通路研究。96 孔培養(yǎng)板每孔100 μL，每組6個復(fù)孔。6 孔培養(yǎng)板每孔2 mL，每組3個復(fù)孔。

2.2MTT檢測細胞增殖抑制率轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。實驗分為陰性對照組和siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后置于酶標儀上，在490 nm 波長下測各組吸光度(A)值。2.3Real-time PCR檢測ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表達量差異變化用TRIzol法提取MSC細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，Tβ4以F:AAAACGGAAACGCAAGA、R:GATTTCACTGTCGTCCCAC；內(nèi)參基因β-Actin以F:CACCACAGCCGAGCGGGAAAT、R:CCGTGTTGGCGTAGAGGT為擴增引物進行Real-time PCR擴增，在進行Real-time PCR時對照組和實驗組均設(shè)置3組平行，利用2-Ct方法計算Tβ4基因在對照組和實驗組相對表達量。Real-time PCR檢測重復(fù)3次。

2.4Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化提取細胞總蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗37 ℃孵育2 h，加入二抗室溫孵育1 h，ECL避光顯色，檢測AKT及P-AKT蛋白的表達，Tubulin為內(nèi)參。

2.5統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.40統(tǒng)計軟件，采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性檢驗。

3結(jié)果

3.1MTT檢測siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染MSC后增殖影響結(jié)果表明，siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染組MSC增殖受到顯著抑制，抑制率為(18.450 1±0.401 7)%。與陰性對照組比較，P<0.01。

3.2Real-time PCR檢測siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染MSC后AKT、CyclinD1及ILK表達影響結(jié)果表明，Real-time PCR檢測siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組ILK、CyclinD1 mRNA表達量明顯下調(diào)，與陰性對照組比較，P<0.01;AKT表達量變化與陰性對照組比較，無統(tǒng)計學意義。

3.3Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化結(jié)果顯示，siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組相對于對照組總的AKT蛋白含量無明顯變化，而P-AKT明顯減少，說明siRNA-Tβ4干擾的Tβ4表達促使磷酸化的AKT減少。

4小結(jié)

本實驗用siRNA干擾MSC中Tβ4表達后，發(fā)現(xiàn)MSC的增殖被明顯抑制，表明Tβ4和MSC增殖密切相關(guān)，Tβ4在鹿茸快速生長中可能起重要調(diào)控作用。

在ILK/AKT信號通路中，當ILK被激活時，將引起下游分子PKB、AKT或GSK-3的磷酸化效應(yīng)，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)影響下游基因表達，最終對細胞增殖和存活產(chǎn)生影響[9-10]。本研究表明Tβ4被沉默后，MSC中的ILK和CyclinD1 mRNA表達量明顯下調(diào)，而AKT盡管在mRNA水平未發(fā)生表達變化，但翻譯后蛋白的磷酸化水平明顯下降。

本實驗結(jié)果進一步表明，Tβ4可以促進MSC增殖，可能的機制為激活I(lǐng)LK，進而活化AKT，促進下游CyclinD1的表達。此研究為后續(xù)鹿茸快速生長機制研究了奠定基礎(chǔ)。

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Effect of siRNA-mediated thymosin β4silence on proliferation in mesenchymal stem cell

XIE Hongmei1,MENG Xiangyu1,SUN Tianxia1,ZHANG Lixuan1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of siRNA-mediated thymosin β4(Thymosin β4,Tβ4) silence on proliferation in activated mesenchymal stem cell(mesenchymal stem cell,MSC) and discuss the possible mechanism.MethodsMSC cells were divided into 2 groups:negative control group and siRNA-Tβ4 transfection group.The siRNA-Tβ4 was transfected into MSC cells and cell proliferation was measured by MTT,Real-time PCR detection ILK,AKT and CyclinD1mRNA expression quantity change,Western blot detection AKT and P-AKT protein content changes.ResultsMSC proliferation was significantly inhibited in siRNA-Tβ4 transfection group(P<0.01);Expression of the ILK,CyclinD1 mRNA of MSC transfected with siRNA-Tβ4 is reduced,AKT quantity remains the same(P<0.01);The siRNA-Tβ4 transfection group no change in total AKT protein,P-AKT protein content decreased.ConclusionThe siRNA-mediated Tβ4 silence significantly inhibits MSC proliferation by up regulating the ILK,p-AKT and CyclinD1expression in MSC.

Keywords：RNA interference;Tβ4;mesenchymal stem cell;ILK/AKT signaling pathway

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.008

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140622003JC)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130101142JC)。

作者簡介：謝紅梅(1989-)，女，碩士研究生，主要從事中藥學研究。

*通信作者：曲毅，女，博士，助理研究員，電話-(0431)86172331，電子信箱-quyi1229@163.com

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2016)03-0462-03

(收稿日期:2016-03-21)