趙繼明，彭?。ㄖ心洗髮W(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410008）

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Micro RNA-132對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的作用

趙繼明，彭健
（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410008）

摘要：目的探討microRNA-132（miR-132）對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系LOVO生物學(xué)功能的作用。方法通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miR-132 mimic的方式進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。以細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)（CCK-8）、平板克隆形成、流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)以及劃痕實(shí)驗(yàn)分析miR-132過(guò)表達(dá)對(duì)LOVO細(xì)胞增殖與侵襲的影響。結(jié)果LOVO細(xì)胞中，外源性過(guò)表達(dá)miR-132能夠抑制其生長(zhǎng)，且抑制率呈時(shí)間、濃度依賴性，50 nmol/L miR-132 mimic處理72 h后，抑制率達(dá)30％。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-132過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-132過(guò)表達(dá)可以抑制LOVO細(xì)胞體內(nèi)的外克隆形成能力。體外平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，miR-132過(guò)表達(dá)使LOVO細(xì)胞克隆形成率從21％降至7％。劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)miR-132各組細(xì)胞的遷移能力降低。結(jié)論miR-132過(guò)表達(dá)能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO發(fā)生細(xì)胞凋亡及增殖，還能削弱結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO的克隆形成能力。

關(guān)鍵詞：microRNA-132；凋亡；增殖；遷移；克隆形成

MicroRNA-132（miR-132）是高度保守miRNA，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白，從人類17號(hào)染色體上基因間隙區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來(lái)[1]。大多數(shù)研究表明，miR-132的調(diào)節(jié)作用和生物學(xué)功能來(lái)源于神經(jīng)元[2]。miR-132在炎癥、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生成等病理過(guò)程中的作用也被學(xué)者們研究證實(shí)[3]。有研究指出，不同類型的人類癌癥中miR-132表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[4]。但是，關(guān)于miR-132對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為作用的系統(tǒng)研究較為少見。

由于不同結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源性miR-132表達(dá)水平可能存在差異，為排除內(nèi)源性miR-132對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)6株結(jié)腸癌細(xì)胞株（HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480）和HCo EpiC正常結(jié)腸細(xì)胞株中miR-132的表達(dá)。選取內(nèi)源性miR-132表達(dá)水平最低的細(xì)胞株作為研究對(duì)象，將miR-132mimics轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞株，建立miR-132過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞模型。檢測(cè)miR-132過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及遷移能力等生物學(xué)行為的影響，以期進(jìn)一步了解miR-132在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞株和正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株中miR-132的表達(dá)。人結(jié)腸上皮細(xì)胞HCo EpiC、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的無(wú)血清細(xì)胞冷凍保存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）高糖培基中。依照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCoEpiC細(xì)胞中總RNA。紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，A260/A280值為1.8～2.0，1％瓊脂糖凝獲電泳檢測(cè)質(zhì)量。分別取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCo EpiC總RNA各1μg，逆轉(zhuǎn)錄酶混合液lμl，5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μl，加無(wú)RNA酶水至反應(yīng)體積為20μl。37℃溫浴60 min，95℃、5 min，終止反應(yīng)。2×PCR預(yù)混液25μl，10×通用引物5μl，10×特異引物Assay 5μl（hsa-miR-132引物序列代號(hào)為MS00004276，U6引物穿列代號(hào)為MS00007497，以U6為內(nèi)參，德國(guó)Qiagen公司提供），cDNA模板2μl，加光RNA酶水定容至總反應(yīng)體積50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，70℃延伸34 s，共8個(gè)循環(huán)。相同條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

由于miR-132在結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞中的表達(dá)最低，因此本研究后續(xù)以LOVO細(xì)胞為研究對(duì)象來(lái)探討miR-132對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。miR-132 mimics購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞分為4組：①空白組，不作任何處理，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；②陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染時(shí)加入無(wú)關(guān)序列Scramble mimics+脂質(zhì)體2000；③實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染時(shí)加入miR-132 mimics+脂質(zhì)體2000；④羧基熒光素（Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）對(duì)照組，轉(zhuǎn)染時(shí)加入FAM-mimics control，該組用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，不再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，接種至雙瓊脂平板，待上層瓊脂凝固后，常規(guī)培養(yǎng)2周。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算形成率。克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100％。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè)

空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，以1 000個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)6個(gè)平行孔，每孔體積為0.2 ml。分別于1、2、3和4 d各取一塊96孔板培養(yǎng)板，超凈臺(tái)內(nèi)棄去原培養(yǎng)液，加入按9∶1混合的培養(yǎng)液與細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)（cell counting kit-8，CCK-8）反應(yīng)液，96孔板繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后取出，輕輕震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值（optical delnsity，OD值），并按以下公式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增殖率：相對(duì)細(xì)胞增殖率（％）=（實(shí)驗(yàn)孔平均OD值-空白調(diào)零平均OD值）/（對(duì)照孔平均OD值-空白調(diào)零平均OD值）×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-132 mimics對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞凋亡的影響。各組膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯（annexin V-fluoresceine isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染，同時(shí)設(shè)置未染色空白對(duì)照管、單染Annexin VFTIC管及單染PI管。將環(huán)氧樹脂（epoxy epoxide，EP）管置于冰上，避光條件下室溫靜置10 min，加入400μl 1×Binding Buffer，輕輕混勻，并在30 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。以未染色空白細(xì)胞為基準(zhǔn)調(diào)零機(jī)器，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管做為基準(zhǔn)參照，測(cè)定每個(gè)上樣EP管的數(shù)據(jù)。采用Cell Quest 3.0軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.6劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-132 mimics對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞遷移能力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組LOVO細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/ml的密度接種于24孔板中，每孔500μl，培養(yǎng)4 h。待細(xì)胞貼壁后用小槍頭沿著每孔偏中線兩側(cè)劃痕，劃痕應(yīng)較直且寬度一致，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffersaline，PBS）清洗1遍，確保清洗掉痕線上散在的細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)平行孔，加入含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液再放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48和72 h，分別于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞向中間的遷移情況，并在顯微鏡下拍照記錄。注意每次拍照的位置應(yīng)固定，且每次拍照前用PBS洗2遍以去除漂浮的死細(xì)胞。計(jì)算閉合率以反映細(xì)胞的遷移能力，閉合率（％）=（遷移距離/劃痕距離）×100％。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間樣本比較用Student’s t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1正常結(jié)腸細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-132的表達(dá)

miR-132在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)基本一致，正常結(jié)腸細(xì)胞HCo EpiC中miR-132呈高表達(dá)，而6種結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-132表達(dá)被不同程度地抑制（見圖1）。其中LOVO細(xì)胞中內(nèi)源性miR-132表達(dá)水平最低。

圖1　正常結(jié)腸細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-132的表達(dá)（P=0.014）。見圖3。

2.2miR-132對(duì)LOVO細(xì)胞克隆形成的作用

用miR-132 imimics（實(shí)驗(yàn)組）轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞，使其過(guò)表達(dá)miR-132，與陰性對(duì)照組（Scramble mimics組）和空白組比較，實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），而陰性對(duì)照組和空白組的克隆數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2　3組克隆數(shù)比較

2.3MiR-132對(duì)LOVO細(xì)胞增殖能力的作用

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法繪制LOVO細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-132 mimics 72 h后，細(xì)胞增殖能力逐漸下降。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞72、96 和120 h增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組和空白組

圖3　miR-132 mimics對(duì)LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)能力的抑制作用

2.4miR-132對(duì)LOVO細(xì)胞凋亡的作用

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的凋亡率分別為（2.94±0.81）％、（3.02±1.12）％和（15.04±1.52）％?？瞻捉M與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.684）；實(shí)驗(yàn)組和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。提示miR-132可促進(jìn)LOVO細(xì)胞凋亡。見圖4。

2.5miR-132對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞遷移能力的作用

分別于24、48和72 h觀察各組細(xì)胞的劃痕修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組LOVO細(xì)胞遷移能力被抑制，48 h后各組遷移能力明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.037）。見附表。

圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡率

附表　3組細(xì)胞在不同時(shí)間的閉合率比較（％，±s）

附表　3組細(xì)胞在不同時(shí)間的閉合率比較（％，±s）

組別　24 h　48 h　72 h空白組　15.21±3.56　27.11±2.52　67.79±3.97陰性對(duì)照組　15.41±2.72　25.42±3.18　68.34±5.62實(shí)驗(yàn)組　11.37±1.44　19.52±3.26　31.34±4.62

3　討論

miRNA是包含19～25個(gè)堿基的小分子非編碼RNAs，能夠通過(guò)與靶基因mRNAs的3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated regions，3’-UTRs）反應(yīng)，反向調(diào)控靶基因表達(dá)。研究證實(shí)，miR-132具有調(diào)控多巴胺神經(jīng)元分化，激活內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮病理血管生成的作用[5]。還有研究表明，miR-132參與胰腺癌的發(fā)展過(guò)程[6]。

近年來(lái)，關(guān)于miR-132對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的作用的研究成果層出不窮，但是這些結(jié)果多有矛盾之處。You等[7]研究表明，miR-132在非小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中顯著下降，且恢復(fù)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，能夠抑制miR-132遷移和侵襲。Zhang[8]等研究發(fā)現(xiàn)，miR-132能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等。Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-132/212簇能顯著抑制肺癌細(xì)胞株H1299在裸鼠皮下的成瘤能力。而Park等[10]在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-132在胰腺癌組織中表達(dá)增加，抑制胰腺癌細(xì)胞株中miR-132表達(dá)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞凋亡加快，侵襲和遷移能力顯著下降。本研究結(jié)果表明，恢復(fù)結(jié)腸癌細(xì)胞中MiR-132的表達(dá)，能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型。MiR-132在不同腫瘤中發(fā)揮相反作用的原因目前仍不清楚，結(jié)合以往研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)其主要原因?yàn)椋孩倌[瘤的異質(zhì)性。不同腫瘤組織間的異質(zhì)性，以及同類腫瘤組織中的異質(zhì)性都可能導(dǎo)致miR-132作用的差異；②腫瘤來(lái)源不同，導(dǎo)致miR-132的作用也不盡相同。有的腫瘤源自內(nèi)皮細(xì)胞，有的源自上皮細(xì)胞，而結(jié)腸癌細(xì)胞主要源自結(jié)腸星狀細(xì)胞；③不同腫瘤組織中靶基因表達(dá)豐度不同也導(dǎo)致miR-132作用差異。眾所周知，miRNA主要通過(guò)靶基因發(fā)揮作用，而且一種miRNA可能存在多種靶基因，而不同腫瘤組織中靶基因表達(dá)豐度不同，導(dǎo)致miR-132作用的靶基因也不一致，從而引起miR-132表達(dá)作用不同。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-132 mimics后，細(xì)胞增殖能力、體外細(xì)胞克隆形成率、抗凋亡能力、體內(nèi)致瘤能力明顯下降，結(jié)果提示，結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型與miR-132表達(dá)缺失有關(guān)。miR-132是結(jié)腸癌治療的潛在有效靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者李書軍等[11]也做過(guò)類似的研究工作，探討miR-132對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞腫瘤調(diào)節(jié)因子FOXA1及mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的miR-132能抑制KYSE150食管癌細(xì)胞增殖，該抑制作用至少部分與FOXA1基因的低表達(dá)有關(guān)。管娣等[12]試圖識(shí)別和發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA，以期能夠作為治療靶點(diǎn)高效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，其為驗(yàn)證miR-132與腫瘤遷移的相關(guān)性，將miR-132轉(zhuǎn)染入高遷移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞遷移率的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-132能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移。管娣等[12]為進(jìn)一步揭示miR-132抑制細(xì)胞遷移的可能機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)手段尋找并鑒定3種可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miR-132的靶基因，其分別是STIP1同源性和含U框蛋白1（STIP1 homologous and U box containing protein1，STUB 1）、GTP酶激活蛋白-Src同源結(jié)構(gòu)域3-結(jié)合蛋白1[GTPase activating protein-（Src homology domain 3）-bindingprotein 1, G3BP1]、GTP酶激活蛋白-Src同源結(jié)構(gòu)域3-結(jié)合蛋白2[GTPase activating protein-（Src-homology domain 3)-binding protein 2, G3BP2]。管娣等[12]分別比較MCF7與MDA-MB-231細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染miR-132和陰性對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞3種基因的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G3BP1、G3BP2可能參與miR-132對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控，與本研究結(jié)果類似。

總之，結(jié)合以往和本研究結(jié)果，miR-132有望成為結(jié)腸癌腫瘤基因治療的潛在高效靶點(diǎn)。

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（童穎丹編輯）

Eeffect of miR-132 on biological characteristics of colon cancer cells

Ji-ming Zhao, Jian Peng
(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of miR-132 on biological characteristics of conlon cancer LOVO cell line.Methods Synthetic miR-132 mimics and miRNAs cramble were transfected into LOVO cells using Lipofectamine 2000.Transwell assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell invasion and metastasis.CCK-8 assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell proliferation.Flow cytometry was used to assess the effect of miR-132 on LOVO apoptosis.Results Over-expression of miR-132 induced LOVO cell apoptosis, and subsequently inhibited LOVO cell growth and colony formation.Notably, 50 nmol/L miR-132 mimic demonstrated a potent inhibitory effect at 72 h after transfection and reduced cell viability by 30％.The colony formation ability was impared after miR-132 mimic treatment with a 14％ drop of in vitro colony formation rate.Also, miR-132 inhibited the LOVO cell migration.Conclusions miR-132 could suppress colon cancer cell growth through induction of cell apoptosis.

Keywords:miR-132; apoptosis; proliferation; migration; colony formation

[通信作者]彭健，E-mail：pengjian1698@aliyun.com

收稿日期：2015-10-16

文章編號(hào)：1005-8982（2016）01-0030-05

中圖分類號(hào)：R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A