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        激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟活疫苗工藝的研究

        2016-03-25 04:07:10鄭朝朝柳珊鄒立宏劉云濤劉濤郁宏偉
        中國(guó)動(dòng)物保健 2016年2期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒豬瘟

        鄭朝朝 柳珊 鄒立宏 劉云濤 劉濤 郁宏偉

        摘要:為建立規(guī)?;囵B(yǎng)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝,本研究利用工作體積為10L的激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞(swine testis,ST),接種豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)進(jìn)行培養(yǎng)研究。研究結(jié)果顯示,培養(yǎng)4d細(xì)胞數(shù)可增長(zhǎng)5-7倍,接種病毒后15d可收獲毒液6次,收獲量至少與200個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶單次收獲量相當(dāng),產(chǎn)品各項(xiàng)檢測(cè)均合格。本工藝極大地縮短了培養(yǎng)時(shí)間,為規(guī)?;囵B(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

        關(guān)鍵詞:豬瘟;脾毒;細(xì)胞毒;激流灌注式生物反應(yīng)器

        豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的一種熱性、急性、接觸性傳染病。此病于1833年首先在美國(guó)等地發(fā)現(xiàn),以后遍及世界各大洲,發(fā)病率和死亡率高,危害極大。豬瘟的治療無(wú)特效藥物,最有效的方法就是疫苗的免疫接種,因此疫苗免疫效果的優(yōu)劣對(duì)豬瘟防控起了決定性作用。2007年9月,豬瘟兔化弱毒脾淋疫苗被農(nóng)業(yè)部定為政府采購(gòu)?fù)茝V應(yīng)用的首選疫苗。

        本研究中應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器(工作體積為10L)對(duì)豬瘟病毒的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了初步探索:以第一代細(xì)胞毒做為毒種,培養(yǎng)15d可收獲毒液6次,各收次病毒液效價(jià)均可達(dá)到1.0×lO6RID/mL以上,病毒收獲量至少與200個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng),且各種檢測(cè)均符合規(guī)程要求。該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比,培養(yǎng)時(shí)間縮短一半,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,效價(jià)高。該工藝的建立為規(guī)?;囵B(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

        1 材料和方法

        1.1 細(xì)胞、病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        豬睪丸細(xì)胞(ST)購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司;豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒(CSFV)由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司種毒室提供;安全檢驗(yàn)用豬瘟抗體陰性豬購(gòu)自河北唐縣某豬場(chǎng);效力檢驗(yàn)用家兔購(gòu)自河北定州某兔場(chǎng)。

        1.2 主要試劑、設(shè)備

        高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GJIBCO公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;豬瘟專用新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司;豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自愛德士元亨試劑公司。AP20C型激流灌注式多功能生物反應(yīng)系統(tǒng)購(gòu)自杭州安普生物工程有限公司(工作容積10L)。

        1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

        以常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代增殖ST細(xì)胞,并檢測(cè)細(xì)胞的單日葡萄糖消耗量。

        1.4 毒種的制備

        取已形成良好單層的ST細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,接種豬瘟脾毒毒種,取二收、三收的毒液做為生產(chǎn)用細(xì)胞毒毒種,備用。

        1.5 細(xì)胞罐體接種與培養(yǎng)

        以常規(guī)方法消化已長(zhǎng)成良好單層的轉(zhuǎn)瓶ST細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),將細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器灌注袋內(nèi),接種密度為1.0-2.0×107cells/g。靜置吸附1h。吸附過程完成后向反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)加入含8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。設(shè)定設(shè)備參數(shù):T1:37℃、T2:40℃、T3:36℃,pH:7.3 ,D0:50%-70%,振蕩速度20r/min,空氣流量100mL/min,啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

        每12h取樣一次,用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)液葡萄糖濃度。當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時(shí),開始補(bǔ)液或者換液,維持殘?zhí)菨舛龋⒏鶕?jù)葡萄糖消耗量,分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

        1.6 病毒接種、培養(yǎng)與收獲

        細(xì)胞培養(yǎng)至第4d葡萄糖消耗量趨于平穩(wěn)時(shí),棄去培養(yǎng)液,用不含血清的DMEM液沖洗灌注袋,接種CSFV細(xì)胞毒毒種800mL,設(shè)定設(shè)備參數(shù),T1:36.5℃、T2:40℃、T3:36℃,pH:7.4,D0:50%-70%啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序,進(jìn)行病毒培養(yǎng)。

        自接毒后每8h取樣測(cè)糖、測(cè)效價(jià),接毒24h補(bǔ)充2倍濃縮DMEM液;前3收每48h進(jìn)行一次收獲換液;4-6收每72h進(jìn)行一次,每次換液后48h補(bǔ)充200g/L的葡萄糖,使殘?zhí)菨舛染S持在1.5g/L。

        1.7、半成品檢驗(yàn)

        無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行。

        半成品病毒含量測(cè)定用豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)兩種方法測(cè)定。

        1.8 疫苗的制備與檢驗(yàn)

        1.8.1 疫苗制備

        將檢驗(yàn)合格的病毒液混合于同一容器,加入牛奶蔗糖凍干保護(hù)劑充分搖勻,定量分裝,迅速冷凍真空干燥即得成品。

        1.8.2 疫苗安全性檢驗(yàn)

        按瓶簽注明頭份,將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份,肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭,每頭5mL,觀察2ld。

        1.8.3 疫苗效力檢驗(yàn)

        疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL,耳靜脈注射家兔2只,1.0mL/只,觀察96h。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

        細(xì)胞復(fù)蘇后,傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(如圖1)。

        2.2 細(xì)胞罐體接種與培養(yǎng)

        接種至激流灌注式生物反應(yīng)器灌注袋的細(xì)胞總數(shù)約2.5×109個(gè)。細(xì)胞接種至反應(yīng)器后,每12h葡萄糖消耗量呈逐步增長(zhǎng)的趨勢(shì)(如圖2),從0.11g/L直至0.90g/L。

        2.3 病毒接種、培養(yǎng)、收獲與檢驗(yàn)

        細(xì)胞培養(yǎng)至第4d(72-96h)葡萄糖消耗量趨于平穩(wěn),約17g/24h,接種豬瘟病毒。

        接毒24h補(bǔ)充2倍濃縮DMEM液;前3收每48h進(jìn)行一次收獲換液;4-6收每72h進(jìn)行一次,每次換液后48h補(bǔ)充200g/L的葡萄糖,使殘?zhí)菨舛染S持在1.5g/L。

        收獲1-6收各收次毒液,檢測(cè)效價(jià),6個(gè)收次的病毒液效力均在1.0×106RID/mL以上(如表1)。

        6個(gè)收次的病毒液按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄進(jìn)行純凈性檢驗(yàn),兀細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)和外源病毒污染;病毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用。

        2.4 疫苗成品的安全和效力檢驗(yàn)

        接種疫苗后觀察2ld,所有試驗(yàn)豬體溫、精神、食欲兀明顯變化,無(wú)異常臨床反應(yīng),疫苗安全檢驗(yàn)合格。

        家兔接種疫苗后觀察4d,2只家兔一只為定型熱(++),另一只為輕熱(+),疫苗效力檢驗(yàn)合格。

        3 討論

        通過本研究成功建立了應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝,應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟病毒能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度生長(zhǎng),而且自動(dòng)化水平較高,生產(chǎn)過程穩(wěn)定可控,降低了產(chǎn)品批間差異,有利于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

        本研究中應(yīng)用工作體積為10L激流灌注式生物反應(yīng)器對(duì)豬瘟病毒的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了探索,新建立的豬瘟病毒生產(chǎn)工藝一個(gè)周期病毒收獲量至少與200個(gè)轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng),該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比,培養(yǎng)時(shí)間縮短一半,大大提高了生產(chǎn)效率,對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本有明顯優(yōu)勢(shì)。

        本研究中采用試劑盒和兔體熱反應(yīng)兩種方法對(duì)半成品毒液進(jìn)行了抗原含量檢測(cè),根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系,因此,應(yīng)用豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原含量有一定的可行性,但是應(yīng)當(dāng)注意到豬瘟抗原試劑盒檢測(cè)的是豬瘟病毒的E2蛋白,而不是整個(gè)病毒,但是存在假陽(yáng)性。(編輯:趙曉松)

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