賀望興 胡桂萍 石旭平 李琛 鄧鵬

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

茶樹根際固氮菌研究進展

賀望興 胡桂萍 石旭平 李琛 鄧鵬

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

隨著綠色生態(tài)農業(yè)興起和發(fā)展，茶產業(yè)進入綠色、生態(tài)、環(huán)保的產業(yè)升級和轉換期。生物固氮是指固氮菌將大氣中的氮氣還原成氨的過程，在綠色生態(tài)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展、化肥減量減施、環(huán)境生態(tài)保護等方面具有重要的意義。茶樹根際固氮菌是指分布于茶樹根際表面土壤環(huán)境中的一類具有固氮能力的微生物，有利于茶樹的生長發(fā)育、品質提升以及茶樹抗逆性增強等作用。從茶樹根際固氮菌的多樣性、影響因素以及對茶樹的作用、研究技術等方面綜述茶樹根際固氮菌的研究進展，同時探討了固氮菌在農業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的應用前景。

茶樹；根際固氮菌；研究進展

1 引言

生物固氮是指固氮菌將大氣環(huán)境中的氮氣通過自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮等方式轉化為可供植物體利用的氮肥的過程。生物固氮是為農作物提供氮肥的主要途徑，是一種保持農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的生物機制，具有經濟、綠色、環(huán)保、無污染等優(yōu)點[1]。植物根際長期受作物根系生理活動的影響，逐步形成特定的物理、化學和生物特性，直接影響著作物的生長、發(fā)育、抗病性、生產力等生理和遺傳特征。

茶樹根際環(huán)境是茶樹根系生長發(fā)育、吸收營養(yǎng)成分和新陳代謝的場所，同時茶樹根系的生長與土壤中棲居的有益微生物群落息息相關。近年來研究學者陸續(xù)在小麥[2]、棉花[3]、玉米[4]等各種植物的體表環(huán)境中篩選到了多種固氮菌，但對于茶樹根際的固氮菌的報道不多。筆者綜述了茶樹根際固氮菌的研究進展，并根據(jù)生物固氮當前的研究熱點，提出了生物固氮作用的發(fā)展趨勢和方向，以期為固氮菌在茶樹生產中利用提供參考，為生態(tài)茶園建設提供技術和理論依據(jù)。

2 茶樹根際固氮菌多樣性

土壤環(huán)境中的固氮菌非常豐富，據(jù)報道目前已經發(fā)現(xiàn)一百多個屬的固氮菌[5]，同時每年還有新發(fā)現(xiàn)的固氮菌不斷被報道[6～7]。茶園中長期種植各種茶樹品種，其土壤環(huán)境已經形成了特定的微生物群落，其中固氮菌是非常重要的功能微生物群落之一，它在氮循環(huán)中扮演著不可或缺的作用，其物種多樣性直接影響著氮循環(huán)進程及固氮資源的利用。

Baldani[8]根據(jù)菌體能否定殖在植物組織內，將固氮菌劃分為根際固氮菌和內生固氮菌。根際固氮菌是指定殖于植物根表的所有固氮細菌。茶樹根際固氮菌主要包括固氮菌屬、氮單孢菌屬、拜耶林克氏菌屬和德克斯氏菌屬等[9]。田永輝采集不同茶園地0～20cm和20～40cm土層中不同茶樹品種的根系，然后通過培養(yǎng)基分離法篩選得到大量茶樹根際固氮菌，菌株鑒定結果表明茶樹根際固氮菌群落組成大致可分為3大類10個種類78個個體[10]：一是活躍固氮微生物，主要由桿狀固氮菌(占14.21%)、梭狀固氮菌(占21.05%)、球狀固氮菌(占13．16%)等組成；二是微嗜氮微生物，主要由芽孢桿菌(占15.16%)、磷細菌(占9.53%)等組成；三是聯(lián)合固氮微生物，主要由真菌類(占12.53%)、放線菌(占1.63%) 等組成。

調查數(shù)據(jù)顯示，山東省公辦園教師月工資收入3500元以下者占86.29%，民辦園占98.07%，公辦園為教師全部辦理“五險一金”的占21.32%，民辦園僅為12.08%?？梢姡瑢W前教師的工資普遍較低，辦理“五險一金”的比例也很低，微薄的工資收入和缺位的社會保障待遇直接影響學前教師的職業(yè)吸引力，造成學前教師的大量流失，使本就匱乏的師資力量雪上加霜。

3 茶樹根際固氮菌的影響因素

3.1 土壤類型及物理性狀

3.3 栽培方式及管理措施

在上述過程中，如果列車ProSe服務器判定列車所在的位置周圍沒有可以進行D2D通信的合適列車，則通知請求列車；請求列車收到相關信息后停止發(fā)送發(fā)現(xiàn)請求，并在一段時間后再重新發(fā)起請求?？紤]到ATS以及ProSe服務器可能因為故障而做出錯誤的判斷，發(fā)起列車識別的列車在收到服務器發(fā)出的無可行車車通信鏈路的報告后，進入周期性的列車自組織發(fā)現(xiàn)過程，以保障行車安全；同時，出于對ATS的信任，設備自組織列車識別過程的周期可以設置的較長，以降低列車通信設備和無線網絡負擔。在列車D2D通信建立后，如果兩列通信列車處于前后位置且當前運行線路一致，則后面的列車可以發(fā)起追蹤請求，進行持續(xù)的通信和精細的追蹤。

3.2 土壤肥力

茶園土壤肥力狀況直接影響茶樹根際土壤中菌群落的組成以及數(shù)量的大小。高旭輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同肥力狀況的土壤茶樹根際土壤中固氮菌等有益細菌數(shù)量差異較大。田永輝等[15]報道當茶樹年齡一致的情況下，茶樹根際土壤中固氮菌的數(shù)量與土壤養(yǎng)分含量成正比例關系，土壤肥力好的土壤固氮菌數(shù)量多，土壤肥力貧瘠的土壤固氮菌數(shù)量少，此時茶樹的樹齡對有益細菌的生長繁殖影響程度最大，只有優(yōu)勢菌種群可以生長繁殖，弱勢群體被淘汰。

土壤類型及物理性狀對茶樹根際固氮菌種群、生長特性以及分布特征具有重要的影響。田永輝等[11]采用定點定位方法研究了土壤類型及物理性狀對茶樹根際固氮菌的影響，研究結果表明：茶園硅質黃壤中根際固氮菌種類數(shù)、個體數(shù)最多，黃壤中根際固氮菌種類數(shù)、個體數(shù)最少，砂頁巖黃壤茶樹根際固氮菌種類數(shù)、個體數(shù)介于兩者之間。李慶康等[12]報道固氮菌類群的生長繁殖受到土壤環(huán)境影響，適應土壤環(huán)境的菌生長旺盛，不適應者被淘汰，最常見不利影響體現(xiàn)在土壤pH值降低，其次是鈣、鎂等鹽含量減少，活性鋁的含量增加等。而在土壤肥力豐富、土質疏松、通氣性好、酸堿度適中的茶園中，土壤微生物總量相對較高[13]。

合理的栽培方式有利于茶樹根際固氮菌的生長，反之，單一的栽培方式不利于茶樹根際固氮菌的生長。韓文炎等[16]報道茶樹根際自生固氮菌的多樣性指數(shù)(Ht)、生態(tài)位寬度指數(shù)(B)值人工生態(tài)茶園>密植免耕茶園>常規(guī)茶園。這主要是因為人工生態(tài)茶園是由多物種、多層次立體群落組成，改善了茶園空間的氣候環(huán)境，提高了茶園土壤物理、化學性狀，為根際固氮菌的生長發(fā)育創(chuàng)造了優(yōu)越的微生態(tài)環(huán)境。密植免耕茶園在層次、立體空間方面較差于人工生態(tài)茶園，但近地空間微氣候環(huán)境又優(yōu)于常規(guī)茶園，所以人工生態(tài)茶園的固氮菌生長最好，常規(guī)茶園最差[17]。

在微課內容上，要保證知識的系統(tǒng)性并做到有始有終。在課程末尾進行一個簡明扼要的總結，使知識結構更加立體。同時幫助學生進行知識點的回顧總結，加深所學知識印象。教學者在課程內容安排上還要做到由淺入深、循序漸進，使學習者能夠接受課程安排。針對重點內容，可以合理創(chuàng)設問題情景并確定啟發(fā)性論題，建立為理解而教的目標，使學生對內容產生濃厚的興趣，主動做課堂的參與者。

茶園的人為管理措施對土壤菌群落的組成和數(shù)量影響也很大，其中尤以施肥的管理措施對土壤微生物的影響最大。在常規(guī)茶園管理中通過施肥來提高茶園土壤養(yǎng)分含量，但是施肥過多會抑制土壤微生物的生長，降低土壤的理化特性。比如氮肥施入過多會抑制大多數(shù)菌類群的繁殖，這主要是因為氮肥在大量長期使用后導致土壤酸化，從而抑制菌的繁殖。茶園通常使用稻草覆蓋的方式來解決茶園水分蒸發(fā)以及雜草叢生等問題，經研究發(fā)現(xiàn)覆蓋方式有利于土壤微生物生長，茶園土壤優(yōu)勢菌種類增多，多樣性更加豐富[18]。同時茶園在使用農藥的同時會抑制土壤中有益菌的數(shù)量，使土壤菌體系退化。

3.4 茶樹根系分泌物

對于黏性情形, 計算域及網格點不變, 取Re=400, 800, 1 600, 3 000, 這是一組低分辨率數(shù)值模擬. 將原始WENO-CU6-M2格式的改進B的結果與已有LES模型對比, 如動態(tài)Smagorinsky模型和Hickel等[21]的自適應局部反卷積模型(adaptive local deconvolution model, ALDM), 且Brachet等[22]的直接數(shù)值模擬(direct numerical simulation, DNS)數(shù)據(jù)用作參照解.

根系分泌物[19]是指在一定生長條件下，茶樹根系釋放到根際土壤環(huán)境中有機物的總稱。根系分泌物不僅為根際菌提供生長所需的能源，而且不同根系分泌物直接影響著根際菌的數(shù)量和種群結構。Darrah等[20]模擬了可溶性碳同根際菌以及死亡量的水平和垂直分布，結果表明：根際菌的分布與沿根的可溶性碳的分布距離有關，菌生物量的積累依賴于根系分泌物的釋放。分泌物越多，菌生長越旺盛；根系分泌物除了可以影響根際菌的種群數(shù)量外，還可以通過改變根分泌物成分來控制根際菌種類。Marschner等[21]通過接種菌根實驗發(fā)現(xiàn)菌根會減少根系分泌有機物的量和改善培養(yǎng)液成分，從而進一步影響到根際某些菌的種群密度和種類。Turner等[22]認為根際礦物營養(yǎng)的改變會影響根系分泌物的種類和數(shù)量，從而間接地影響根際菌的種群密度和種類。這就是不同植物根際發(fā)育不同種類菌的原因。根系分泌物作用于根系周圍環(huán)境產生根際效應，同時根際菌在植物根系趨向性聚居并通過各自的代謝活動分解轉化根系分泌物和脫落物，對根系分泌物起著重要的修飾限制作用。根系分泌物數(shù)量增加，為根際菌提供了更多的能源，促進根際菌的新陳代謝。根際菌種類和數(shù)量豐富，根系發(fā)達，根際分泌物多，從而促進茶樹的生長發(fā)育。

4.1 有利于茶樹的生長發(fā)育和品質提升

除了以上影響因素外，田永輝[15]報道茶樹根際固氮菌還受到茶樹樹齡和品種的影響，具體表現(xiàn)為：青壯年的茶樹根際土壤中固氮菌群落結構復雜穩(wěn)定，而茶樹處于衰老期時固氮菌群落結構單一，數(shù)量少；優(yōu)良品種的茶樹根際菌群落的多樣性指數(shù)大、數(shù)量多，茶樹生長旺盛。高旭輝[14]報道季節(jié)對茶樹主要根際菌的數(shù)量以及種類有很大影響，在9～10月份最多，1月份最少，推測主要是與各季節(jié)內溫濕度有關系。

的確，作為一個專精于打造全地形SUV的品牌，路虎一直做得很出色。但如果僅僅依靠簡單可靠的衛(wèi)士系列和身價有些高不可攀的攬勝家族，這個品牌也絕對發(fā)展不到今天的規(guī)模。在上世紀80年代末，一個在野外和公路，實用與舒適之間平衡得恰到好處的全新車型的面世，讓路虎品牌有了長足的發(fā)展和進步，也讓更多消費者體驗到了SUV這個在當時還算新穎的概念的獨到之處。

4 根際固氮菌對茶樹的作用

3.5 其他

茶樹生物菌肥在提高茶葉產量和品質方面已經顯示出較好的應用前景。茶樹根際土壤中固氮菌的種類、數(shù)量越多，茶樹生長越好，茶葉品質越高。成澤艷[23]采用單因素隨機區(qū)組試驗設計方法，研究了茶樹生物菌肥、化肥和有機肥等施肥方案對茶葉產量和茶葉芽頭密度、百芽重、茶多酚、咖啡堿和氨基酸含量等主要生化性狀的影響。試驗結果表明：施用生物菌肥、化肥和有機肥均能使茶葉主要理化性狀明顯提高，但施用生物菌肥在提高茶葉產量以及茶葉中茶多酚、咖啡堿和氨基酸含量效果最顯著。究其原因是由于固氮菌等菌肥可以提高茶樹的光合效率和茶樹根系酶活性，能分泌多種植物激素，促進作物根系生長，提高茶樹對磷、氮、鉀、鎂、銅、鈣和鐵等礦質元素的吸收能力。

4.2 提高抗逆性

地理以及環(huán)境因素的影響是不可避免的。比如在春夏雨水較多的季節(jié)，高速路面會形成積水，長此以往也會影響到高速公路橋梁的結構。除此之外，有些地方冬季氣溫驟降，低溫會導致路面的開裂；而冬季降雪后雪水融化滲入混凝土，又會對內部構造進行腐蝕，最終導致橋面的開裂，影響高速公路的使用。如果不能及時對這些問題進行解決，那么便會嚴重縮短高速公路橋梁的使用壽命。

固氮菌可以通過營養(yǎng)競爭和位點競爭來抑制病原菌生長。通常在植物根系表面存在著一塊適合細菌生長和繁殖的有利區(qū)域，該區(qū)域具有根系分泌物較多、水分濕度較大等適合細菌生長的環(huán)境優(yōu)勢，固氮菌等促生菌可以搶先占據(jù)這些位點，阻止病原菌在這些位點地建立，然后充分地利用根圍營養(yǎng)和分泌物，減少病原菌生長所必需的營養(yǎng)物質，從而提高茶樹等作物的抗逆性。丁延芹等[24]報道固氮菌等促生菌通常可以產生大量的鐵載體，該載體對Fe3+具有超強絡合能力，其主要功能是向菌提供鐵素養(yǎng)分。當鐵載體產量豐富的促生根際細菌在與不能產生鐵載體或者產生較少的有害菌競爭鐵元素養(yǎng)分時占有優(yōu)勢，進而抑制有害菌在根際的生長和繁殖并表現(xiàn)出生防作用。其他抗逆機制還有諸如通過分泌蛋白類抗菌物質或者非蛋白類抗菌物質來抑制病原菌生長；利用生物或者非生物因子處理植物，誘導植物高表達產生一些具有抗逆活性的物質，從而形成一套物理的或者化學的防御機制，來提高植物的抗逆性。

5 茶樹固氮菌的研究方法進展

除了傳統(tǒng)方法，如用傳統(tǒng)菌株篩選方法從環(huán)境中篩選出固氮菌，用16S rRNA測序技術對固氮菌進行分子鑒定，對固氮菌的影響因素分析以及固氮菌的功效研究等，目前固氮菌研究技術已發(fā)展到基因組學和蛋白質組學分析。大量模式根瘤菌[25]和豆科植物[26～29]的全基因組已經完成測序，這些序列信息為研究固氮菌的功能基因組學和蛋白質組學奠定了基礎。在基因組學的基礎上進一步發(fā)展出了比較基因組學、功能基因組學、轉錄組學以及蛋白質組學和代謝組學，這些方面的研究進一步促進了固氮菌與宿主植物互作的分子機理、固氮基因的起源和進化、基因的水平轉移等內容的研究。在比較基因組學上，對豆科植物根瘤和共生菌根的基因組差異研究，有助于揭示兩者與共生相關的基因及其調控機制。在轉錄組學上，國外學者的研究主要集中在對根瘤菌轉錄組的分析上以及轉錄組對共生體形成的分子調控方面[30]。蛋白質組學是基因組學和轉錄組學的最終體現(xiàn)，目前對蛋白質組學的研究主要體現(xiàn)在根系-菌互作以及蛋白質互作方面[31]。代謝組學研究有助于闡明類菌體中小分子效應物參與的碳代謝、氮代謝、硫代謝及其調控體系，有助于了解生物固氮分子機理，揭示代謝之間復雜的偶聯(lián)調控機制。隨著基因組學和蛋白質組學的發(fā)展，從分子水平到代謝途徑通過譯碼豆科植物和非豆科植物的差異，為非豆科植物共生結瘤固氮提供理論支撐。無疑，基因組學和蛋白質組學的研究具有重要的理論意義和實踐意義。

6 結論與展望

目前，茶樹根際固氮菌在改良土壤、提高土壤養(yǎng)分含量、提高茶葉品質和產量、生物防治等方面已有所研究，但人們對茶樹根際固氮菌的研究還尚未重視，尤其是茶樹根際固氮菌與茶園土壤酶、微生物多樣性及茶樹根系生長發(fā)育的關系方面的研究還非常少。隨著基因組學和蛋白質組學等現(xiàn)代新科學的發(fā)展和滲透，人們對固氮菌的研究也將進入一個更高的發(fā)展階段，茶樹根際固氮菌與宿主植物互作的分子機理、調控機制以及固氮基因的起源和進化等方面的研究將得到廣泛關注。固氮菌的深入研究發(fā)展，特別是豆科植物的共生固氮體系應用到非豆科植物體內將直接增加全球每年由固氮生物固定的氮肥量，提高農作物產品的質量和品質，將進一步有效減少農作物生產過程中的施肥量，降低農作物生產成本，緩解施用過量化肥對全球生態(tài)環(huán)境的污染程度。有利于我國農業(yè)結構的調整，推動我國現(xiàn)代農業(yè)走綠色、生態(tài)、環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展道路。

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江西省科技廳支撐重點項目(編號：20151BBF6001)，江西省科技合作重點項目(編號：20161BBH80071)。