吳麗娜，曹錫忠，蔡建和

(江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇　南京　210001)

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基于鉑/碳球的乙酰膽堿酯酶傳感器在農(nóng)藥樂果檢測中的應用研究

吳麗娜*，曹錫忠，蔡建和

(江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京210001)

摘要：基于農(nóng)藥樂果對乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構(gòu)建生物傳感器，實現(xiàn)了農(nóng)藥樂果的快速、高靈敏檢測。合成了納米材料鉑/碳球(Pt/Cs)，利用其比表面積大、導電性好的優(yōu)勢，構(gòu)建乙酰膽堿酯酶(AChE)傳感器。鉑/碳球修飾電極比裸電極的阻抗更低，峰電流增加了147.06%，說明該材料能很好地保持酶的催化活性。在最優(yōu)實驗條件下，用AChE傳感器檢測農(nóng)藥樂果，在1.0×10-9~1.0×10-6g/L范圍，樂果濃度的負對數(shù)與抑制率呈良好的線性關(guān)系,其檢出限為7.3×10-12g/L(按抑制率為10%計算)。對紡織品樣品進行加標回收實驗，測得回收率為86.2%~101.7%。

關(guān)鍵詞：鉑/碳球；生物傳感器；乙酰膽堿酯酶;樂果；紡織品

有機磷農(nóng)藥因效果好、成本低，在我國農(nóng)村得到了廣泛應用。但其在使用過程中，會殘留在食品、紡織品中，進入人體，對人體產(chǎn)生致癌、致畸作用，近年來已被明確禁止使用。目前有機磷農(nóng)藥的檢測方法中氣相色譜-質(zhì)譜法應用最為普遍，但針對熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥(如樂果等)存在重現(xiàn)性差、結(jié)果不穩(wěn)定的問題，而且檢測成本較高、時間長、操作復雜，只適合在實驗室進行，不適于現(xiàn)場實時檢測[1]。

電化學酶傳感器法由于成本低、靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點，成為有機磷農(nóng)藥的重要分析方法之一。近年來多種基于乙酰膽堿酯酶(AChE)或者有機磷水解酶的電化學或光學傳感器在有機磷農(nóng)藥的檢測中發(fā)揮了重要作用[2-5]。為了保護和提高酶的活性，提高傳感器的靈敏度，金膠納米粒子、碳納米管等納米材料被應用于電化學傳感器中[6-11]。與碳納米管相比，碳球具有能夠負載客體分子的多孔納米結(jié)構(gòu),粒度大小較均勻和較好的穩(wěn)定性等優(yōu)點[12-15]。而納米鉑則具有良好的導電性和生物相容性，被廣泛地應用于酶或生物分子的固定[16-17]。

本文合成了一種納米復合材料鉑/碳球，并利用其比表面積大、電子傳導性好的優(yōu)勢，制備了靈敏的AChE傳感器，用于檢測有機磷農(nóng)藥樂果。該傳感器具有較好的靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。目前尚未見該材料用于農(nóng)藥樂果檢測的報道。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

氯化硫代乙酰膽堿(ATCl，Sigma公司)，AChE(C3389型，500 U/mL，Sigma公司)，樂果標準溶液(分析純，中國藥品生物制品檢定所)。實驗所用的化學試劑均為分析純。

電化學實驗在電化學工作站CHI-660E(上海辰華儀器有限公司)上進行，實驗采用三電極系統(tǒng)，玻碳電極(GC)為工作電極，鉑(Pt)電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極。

1.2實驗內(nèi)容

1.2.1碳球和鉑/碳球材料的制備碳球和鉑/碳球根據(jù)參考文獻[18]制備，具體如下：碳球的制備以甲醛-間苯二酚為先驅(qū)體，采用St?ber方法，在8 mL乙醇與 20 mL去離子水的混合溶液中加入0.1 mL氨水(25%，質(zhì)量分數(shù))，1 h后，加入0.2 g間苯二酚，攪拌至完全溶解后，再滴加0.284 mL甲醛溶液(37%)，混合液在30 ℃攪拌24 h，然后將混合液移至水熱釜中，100 ℃反應24 h，混合物經(jīng)離心分離，100 ℃下干燥48 h。然后進行炭化處理，以1 ℃/min的升溫速率加熱至350 ℃，保持2 h，再以1 ℃/min加熱至600 ℃，煅燒4 h，自然冷卻至室溫。

鉑/碳球采用乙二醇還原法制備，步驟為：取80 mg碳球加至150 mL乙二醇溶液中，超聲分散30 min后得到均勻碳漿，緩慢加入含20 mg Pt的氯鉑酸溶液，攪拌2 h后，滴加0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 10.0，升溫至130 ℃還原3 h。冷卻后真空抽濾，得黑色產(chǎn)物，用大量的去離子水洗滌，50 ℃干燥12 h，得到鉑/碳球納米復合材料。

1.2.2電極制備分別取稀釋至120 U/mL的AChE、0.5%戊二醛和1%的牛血清蛋白按體積比1∶1∶1混合，用交聯(lián)法將6 μL 1∶1∶1的酶混合液固定到裸電極表面，制作AChE/GC電極。分別取5 μL的Cs和Pt/Cs以及6 μL酶混合液，依次滴涂到電極表面，制作AChE/Cs/GC電極和AChE/Pt/Cs/GC電極。

今年初在《偶像練習生》節(jié)目中，范丞丞拿手的rap竟頻頻忘詞甚至中斷表演，他委屈地說，“就像種的菜一樣，等它可以收成的時候，一下子被偷光了一樣，一下子什么都沒了?！碑斖恚侗窗l(fā)文鼓勵：“沒關(guān)系的！菜被偷了還可以再種不是嗎？加油吧！”

1.2.3紡織品樣品溶液的制備紡織品樣品先剪碎成5 mm×5 mm碎片，稱取1 g，加入5 mL 0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液，90 ℃超聲提取30 min后，冷卻待用。

2結(jié)果與討論

2.1電極的電化學表征

圖1　GC(a)、Cs/GC(b)、Pt/Cs/GC(c)電極在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.1　Cyclic voltammograms of bare(a), Cs(b) and Pt/Cs(c) modified electrodes in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-scan rate:0.1 V/s

圖2　GC(a)，Cs/GC(b)，Pt/Cs/GC(c)，AChE/Pt/Cs/GC(d)電極在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗圖Fig.2　Electrochemical impedance spectra of bare(a),Cs(b),Pt/Cs(c)and AChE/Pt/Cs(d) modified electrodes in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-

圖3　AChE/GC(a)，AChE/Cs/GC(b)，AChE/Pt/Cs/GC(c)電極在含1.5 mmol/L ATCl的PBS緩沖液中的差分脈沖圖Fig.3　Differential pulse stripping voltammetric curves of AChE(a), AChE/Cs(b), AChE/Pt/Cs(c)modified electrodes in PBS containing 1.5 mmol/L ATCl

圖4　在含1.5 mmol/L ATCl的PBS緩沖液中加入2.0×10-3 g/L樂果標液前(a)后(b)AChE/Pt/Cs/GC修飾電極的差分脈沖伏安圖Fig.4　Differential pulse stripping voltammetric curves of AChE/Pt/Cs modified electrodes in PBS containing 1.5 mmol/L ATCl without(a)and with 2.0×10-3 g/L dimethoate(b)

在5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，依次對裸玻碳電極(GC)、碳球修飾電極(Cs/GC)、鉑/碳球修飾電極(Pt/Cs/GC)進行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，GC電極的氧化峰電流為49.77 μA，Cs/GC電極的氧化峰電流為59.21 μA，峰電流升高了18.97%，Pt/Cs/GC電極的氧化峰電流為78.78 μA，峰電流升高了58.29%。由此可知，玻碳電極在碳球修飾后，反應表面積增大，電催化活性增強，反應速率加快，并且Pt/Cs/GC電極的導電性大于Cs/GC電極。

在鐵氰化鉀溶液中，依次對裸GC電極、Cs/GC電極、Pt/Cs/GC電極進行交流阻抗掃描，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Cs/GC電極的電阻約為700 Ω，Pt/Cs/GC電極的電阻約為200 Ω，AChE/Pt/Cs/GC電極的電阻約為1 000 Ω。所以Pt/Cs/GC電極的導電性比Cs/GC電極強，靈敏度更高；AChE為非導電物質(zhì)，可以阻礙電子的轉(zhuǎn)移，所以AChE/Pt/Cs/GC電極的電阻較大，說明酶已被很好地固定在電極上。

2.2不同AchE傳感器的電化學行為

圖3為不同電極在1.5 mmol/L氯化乙酰膽堿(ATCl)PBS緩沖溶液中的差分脈沖伏安圖。由圖可知，AChE/GC電極上的峰電流為0.713 6 μA,AChE/Cs/GC電極上的峰電流為1.260 μA，AChE/Pt/Cs/GC電極上的峰電流為1.763 μA。與AChE/GC電極相比，電極經(jīng)Cs和Pt/Cs修飾后電流值分別增加了76.57%和147.06%。由此可知，用Cs和Pt/Cs修飾的玻碳電極，具有較高的電催化活性以及較好的電極靈敏度，且用Pt/Cs具有更好的效果。

2.3有機磷農(nóng)藥的抑制

2.4抑制時間的選擇

在1.5 mmol/L的ATCl溶液中加入2.0×10-6g/L樂果標準液后，每隔2 min用差分脈沖伏安法掃描，作抑制率與時間的折線圖。結(jié)果顯示，隨著抑制時間的增加，抑制率增大。16 min后，抑制率趨于平緩。因此，選擇樂果對酶的最佳抑制時間為16 min。

2.5標準曲線的繪制

在AChE/Pt/Cs/GC電極上，加入不同濃度的樂果標準溶液，16 min后用差分脈沖伏安法掃描，計算樂果的抑制率，繪制樂果濃度的負對數(shù)與抑制率的關(guān)系曲線。結(jié)果表明，抑制率隨其濃度的增加而增加，在1.0×10-9~1.0×10-6g/L濃度范圍內(nèi)，抑制率(A)與樂果濃度(C)的負對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。線性方程為A=-7.100 lgC+89.07，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 7。按照抑制率為10%計算，得到檢出限為7.3×10-12g/L。

2.6實際樣品的檢測

表1　樣品的平均加標回收率

將AChE/Pt/Cs/GC修飾電極置于含有1.5 mmol/L ATCl的PBS溶液中，用差分脈沖伏安法掃描，記錄其峰電流。然后將電極置于含有1.5 mmol/L ATCl的紡織品樣品提取液(PBS提取,不含農(nóng)藥)中，加入3種不同濃度的樂果標準品后，進行差分脈沖伏安法掃描，平行測定5次，計算其平均回收率(見表1)。結(jié)果顯示，樣品的回收率為86.2%~101.7%，相對標準偏差(RSD)為1.7%~10.4%，方法的準確度與精密度可以滿足實際檢測的需求。

3結(jié)論

利用新型的納米材料鉑/碳球，構(gòu)建乙酰膽堿酯酶生物傳感器。鉑/碳球/乙酰膽堿酯酶修飾電極能夠催化底物氯化硫代乙酰膽堿的氧化還原反應。農(nóng)藥樂果對乙酰膽堿酯酶的催化活性能夠產(chǎn)生抑制，納米材料鉑/碳球的納米結(jié)構(gòu)可以輔助固定生物分子，提高檢測靈敏度。據(jù)此可以實現(xiàn)對紡織品中農(nóng)藥樂果的測定，建立紡織品中農(nóng)藥樂果的篩選方法。與傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜方法相比，該方法可以大大減少有機試劑的消耗，縮短檢測時間。

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Acetylcholinesterase Biosensor Based on Pt/Carbon Spheres for the Detection of Dimethoate

WU Li-na*，CAO Xi-zhong,CAI Jian-he

(Jiangsu Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China)

Abstract：A biosensor for dimethoate was prepared by exploiting their inhibitory effect on the activity of acetylcholinesterase(AChE).Carbon/Pt sphere material with good chemical stability, large surface area and good conductivity was used to modify the electrode.Compared to a bare electrode, the electron transfer resistance of the prepared electrode is lower,and its peak current is increased by 147.06%.This is ascribed to the larger surface of the Carbon/Pt ball material which could improve theadsorption for AChE and enhance its activity.Under the optimal experimental conditions , the concentration of negative logarithm of dimethoate and inhibition ratio showed a good linear relationship from 1.0×10-9g/L to 1.0×10-6g/L.The detection limit was 7.3×10-12g/L(the inhibition rate was 10%).The spiked recoveries for textile samples were in the range of 86.2%-101.7%.The method may provide a new way to fabricate highly sensitive biosensors for the detection of organophophate pesticides in textile.

Key words：Pt/Porous carbon spheres;biosensor;acetylcholinesterase;dimethoate;textile

中圖分類號：O657.1；F767.2

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2016)02-0241-04

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.018

*通訊作者：吳麗娜，博士，高級工程師，研究方向：紡織品檢測、分析化學，Tel：025-52345220，E-mail：12889788@qq.com

基金項目：國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201310059)；國家質(zhì)檢總局基金資助項目(2014IK166)

收稿日期：2015-07-22；修回日期：2015-08-04