陳　嬌，周　佳，韋雙雙，李海昌，溫成平*，許國(guó)旺

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所，浙江　杭州　310053；

2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧　大連　116023)

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基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的痛風(fēng)病人血清代謝特征分析

陳嬌1，周佳1，韋雙雙1，李海昌1，溫成平1*，許國(guó)旺2*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所，浙江杭州310053；

2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

摘要：痛風(fēng)是一組僅見(jiàn)于人類的異質(zhì)性疾病，隨著時(shí)間的推移，將導(dǎo)致慢性關(guān)節(jié)炎并逐漸致殘。該研究將基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于痛風(fēng)病人的血清代謝特征分析。首先利用GC-MS獲得痛風(fēng)病人和健康人的血清代謝指紋圖譜，采用多變量統(tǒng)計(jì)分析對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。主成分分析(PCA)得分圖顯示，痛風(fēng)病人與健康人的血清代謝譜有差異。通過(guò)偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分型，根據(jù)模型的變量重要性因子(VIP值)及非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果篩選差異代謝物。共篩選出43種可能與痛風(fēng)相關(guān)的代謝物，并對(duì)其中22個(gè)變量進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，主要包括丙二醇、2,3-二羥基丁酸、2,4-二羥基丁酸、赤蘚糖醇、蘇糖醇、蘇糖酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖酸、肌醇、次黃嘌呤、尿酸、尿苷、3-羥基-3-甲基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、吲哚-3-乳酸、單乙醇胺、甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸等代謝物。與健康人相比，痛風(fēng)病人的糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝及脂類代謝均發(fā)生了明顯的紊亂。這些結(jié)果將為痛風(fēng)臨床診斷及治療提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：痛風(fēng)；代謝組學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；血清

痛風(fēng)曾被稱作“病中之王”，其與其他疾病的高并發(fā)率及日漸升高的死亡率，已經(jīng)使之成為當(dāng)今世界困擾人類的主要疾病之一[1]。痛風(fēng)是由于尿酸或尿酸鹽結(jié)晶在細(xì)胞外液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)導(dǎo)致晶體沉積而引發(fā)的一類以急性反復(fù)性發(fā)作的晶體性關(guān)節(jié)炎為臨床特征的嘌呤代謝紊亂疾病[2]。不同人群的總體患病率約為1.4%[3]，且在世界范圍內(nèi)有增加的趨勢(shì)[4]，已成為男性中最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎癥疾病[5]。

痛風(fēng)是人類認(rèn)識(shí)的最古老疾病之一，在與之斗爭(zhēng)的漫長(zhǎng)歲月中，人類對(duì)它有著深刻的認(rèn)識(shí)。但隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的積累及新技術(shù)的應(yīng)用，新的問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)[6]。1977年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，將高尿酸(男性>7 mg/dL,女性> 6 mg/dL)作為唯一的血清學(xué)診斷指標(biāo)[7]，但有證據(jù)顯示將尿酸水平作為痛風(fēng)的診斷標(biāo)志易導(dǎo)致不確定診斷[8]。疾病分期對(duì)于正確認(rèn)識(shí)痛風(fēng)及臨床指導(dǎo)十分重要，目前普遍根據(jù)自然病程進(jìn)行分期，但無(wú)法體現(xiàn)痛風(fēng)不同階段的病理基礎(chǔ)[9]；而且這種分期方法側(cè)重于將痛風(fēng)定義為反復(fù)發(fā)作的急性爆發(fā)性疾病而忽略了晶體慢性沉積的影響，將會(huì)給痛風(fēng)的有效管理和治療造成一定的阻礙[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)雖然對(duì)痛風(fēng)的病因機(jī)制了解得較為深入，但是臨床仍存在治療不當(dāng)?shù)膯?wèn)題[4]。因此，需要對(duì)痛風(fēng)這一古老疾病進(jìn)行新的更深入的研究，從而更好地指導(dǎo)臨床診斷及治療。

代謝組學(xué)，作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支，是通過(guò)考察機(jī)體受到刺激或擾動(dòng)后體內(nèi)小分子代謝物的變化來(lái)研究生物體系的一門科學(xué)[11-12]。主要研究反映病理生理等刺激和擾動(dòng)引發(fā)的機(jī)體內(nèi)源性代謝物的變化，在疾病診斷、發(fā)病機(jī)制探討及藥效學(xué)評(píng)價(jià)等方面具有極大的優(yōu)勢(shì)[13-15]。基于1H-核磁共振(NMR)的關(guān)節(jié)液代謝組學(xué)方法已被用于包括痛風(fēng)及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各類關(guān)節(jié)炎的區(qū)分[16]。也有學(xué)者基于高效液相色譜-二極管陣列法(HPLC-DAD)的代謝組學(xué)方法對(duì)痛風(fēng)患者血清和尿液代謝物變化進(jìn)行研究[17]。但較少有報(bào)道將氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)應(yīng)用于痛風(fēng)的代謝組學(xué)研究。GC-MS是應(yīng)用非常廣泛的一種代謝組學(xué)分析方法，其高靈敏度及高分離效率非常適合進(jìn)行全組分分析。與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)相比，GC-MS無(wú)明顯的離子抑制效應(yīng)[18]，而且在色譜分析及質(zhì)譜碎片的重復(fù)性方面有明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究擬用GC-MS方法對(duì)痛風(fēng)病人的血清代謝輪廓進(jìn)行研究，并利用多變量統(tǒng)計(jì)分析對(duì)代謝物進(jìn)行模式識(shí)別，分析痛風(fēng)病人及正常人的血清代謝指紋譜差異，篩選差異代謝物并加以鑒定，尋找痛風(fēng)病人體內(nèi)潛在的代謝變化及其相關(guān)代謝途徑，并進(jìn)行相關(guān)討論。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

甲醇(色譜純，Tedia公司，F(xiàn)airfield,OH,USA)；甲氧胺、N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、吡啶及定性所用標(biāo)準(zhǔn)樣品(Sigma-Aldrich公司，St.Louis,MO,USA)；超純水由Milli-Q 系統(tǒng)(Millipore Corp,Millipore,MA,USA)提供。

Agilent 7890/5975C GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)；冷凍離心濃縮儀(Labconco CentriVap System,Labconco.Kansas,MO,USA)。

1.2樣品采集及預(yù)處理

血清樣本包括29例痛風(fēng)患者及26例健康人對(duì)照組。痛風(fēng)患者樣本納入標(biāo)準(zhǔn)符合1977年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，平均年齡為50.3±11.4歲，血尿酸的平均值為514.3±102.7 μmol/L。所有樣本采集后置于-80 ℃保存。

血清樣本處理方法：分析時(shí)，先將樣本置于室溫下解凍并混勻；50 μL 血清中加入200 μL冷甲醇(此操作在冰水浴中進(jìn)行)，渦旋30 s后離心10 min(4 ℃,12 000 g/min)；取上清液凍干，分析前復(fù)溶于50 μL甲氧胺吡啶(20 mg/mL)中，在40 ℃水浴中肟化反應(yīng)90 min；再加入40 μL MSTFA，40 ℃水浴下衍生反應(yīng)60 min。質(zhì)量控制(QC)樣品制備：將進(jìn)行分析的全部血清樣本取等量混勻后，按照上述方法進(jìn)行相同處理，得到QC樣品。

1.3GC-MS分析條件

采用DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,J & W Scientific,Folsom,CA,USA)進(jìn)行分離；進(jìn)樣體積為1 μL，分流比為10∶1；載氣為氦氣(99.999 6%)，流速為1.2 mL/min；柱溫箱升溫程序：初始70 ℃保持3 min后，以5 ℃/min升溫至300 ℃，并保持5 min；進(jìn)樣口溫度為300 ℃，傳輸線溫度為280 ℃；電子轟擊離子(EI)源溫度為230 ℃；溶劑延遲時(shí)間為4.8 min；質(zhì)譜掃描范圍m/z33~600；分析過(guò)程中隨機(jī)安排樣本進(jìn)樣順序，每隔10個(gè)樣本加入1個(gè)QC樣品檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)處理

利用AMDIS 2.62軟件(NIST,Boulder,CO,USA)對(duì)GC-MS得到的代謝譜圖進(jìn)行峰識(shí)別及重復(fù)峰解析，在MSD工作站(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)進(jìn)行積分，得到由質(zhì)荷比、保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣。經(jīng)方差歸一化標(biāo)度(UV Scaling)后，用SIMCA-P 11.0(Umetrics AB,Umea°,Sweden)軟件對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)。根據(jù)VIP值篩選差異代謝物，并利用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS 21,International Business Machines Cor.,Armonk,USA)進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為p<0.05；依據(jù)所獲得的質(zhì)譜圖，利用NIST05數(shù)據(jù)庫(kù)(National Institute of Standards and Technology,Gaithersburg MD,USA)對(duì)篩選的差異代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最后用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2結(jié)果與討論

2.1代謝組學(xué)方法考察

圖1　QC樣品的PCA分析結(jié)果Fig.1　The PCA score plot of QC samples

圖2　痛風(fēng)病人(A)和健康人(B)血清的典型總離子流色譜圖Fig.2　Representative total ion current(TIC)chromatograms of serum from patients with gout(A)and healthy controls(B)

經(jīng)去卷積后，共檢測(cè)到324個(gè)代謝物信息。為了考察分析方法的穩(wěn)定性，在分析序列中每隔6個(gè)樣本加入1個(gè)QC樣品。對(duì)QC樣品進(jìn)行PCA分析(如圖1所示)，所有QC樣品均在2倍SD范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法的重復(fù)性好，能夠滿足代謝組學(xué)的分析要求。

2.2血清代謝組學(xué)分析

對(duì)痛風(fēng)病人和健康人對(duì)照組的血清樣本進(jìn)行GC-MS分析，得到的典型總離子流色譜圖如圖2所示。經(jīng)過(guò)修正80%規(guī)則[19]去除缺失值后，共得到197個(gè)變量進(jìn)行下一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

PCA是一種無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別分析方法，可在多維空間對(duì)樣本間差異進(jìn)行直觀顯示。如圖3A所示，在PCA模型中，痛風(fēng)病人和健康人兩組樣品的代謝表型有一定的區(qū)分，說(shuō)明痛風(fēng)病人和健康人的血清代謝指紋存在差異。為了更好地對(duì)痛風(fēng)病人與健康人的血清代謝譜進(jìn)行分型并篩選差異代謝物，對(duì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析。PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，目的是建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使樣本間達(dá)到最大分離。建立的模型解釋能力參數(shù)R2Y=0.809，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.531，置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示該模型不存在過(guò)擬合的現(xiàn)象。圖3B是PLS-DA得分圖，可以看到痛風(fēng)病人與健康人的血清代謝差異區(qū)分更加明顯。

根據(jù)PLS-DA模型的VIP值來(lái)篩選差異代謝物，VIP>1的變量被認(rèn)為對(duì)分類起著關(guān)鍵作用(圖3C)。對(duì)篩選的差異代謝物進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)符合VIP>1且p<0.05的43個(gè)變量被認(rèn)為與痛風(fēng)有潛在關(guān)聯(lián)。利用NIST05數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)變量可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)鑒定結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，最終共鑒定出22種代謝物(見(jiàn)表1)。與健康人對(duì)照組相比，痛風(fēng)病人的碳水化合物代謝(丙二醇、2,3-二羥基丁酸、2,4-二羥基丁酸、赤蘚糖醇、蘇糖醇、蘇糖酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖酸、肌醇)、核苷酸代謝(次黃嘌呤、尿酸、尿苷)及氨基酸代謝(3-羥基-3-甲基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、吲哚-3-乳酸)相關(guān)物質(zhì)的水平均顯著上調(diào)；脂類代謝(單乙醇胺、甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸)水平及甘氨酸、亞?；撬岬难搴匡@著下降。

2.3痛風(fēng)相關(guān)代謝途徑的變化

痛風(fēng)是由于嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致血尿酸水平升高而引發(fā)尿酸鹽晶體沉積所致的一組代謝性疾病。對(duì)痛風(fēng)病人體內(nèi)代謝途徑變化的研究將為痛風(fēng)的診斷及治療提供重要依據(jù)。本研究結(jié)果(圖4)顯示，與健康人相比，痛風(fēng)患者糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝及脂類代謝均發(fā)生了一定程度的紊亂。

本研究發(fā)現(xiàn)在痛風(fēng)病人的血清中尿酸及次黃嘌呤水平發(fā)生了顯著升高，也有研究證明這兩項(xiàng)水平升高是痛風(fēng)的典型特征[20]。尿酸鹽合成過(guò)多是繼發(fā)性痛風(fēng)的重要病因之一。人尿酸合成的速度主要取決于細(xì)胞內(nèi)磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的濃度。尿苷是PRPP的下游產(chǎn)物，D-葡萄糖酸是葡萄糖氧化的產(chǎn)物，能夠轉(zhuǎn)化為PRPP，二者在本研究中均被檢測(cè)到顯著上調(diào)，說(shuō)明痛風(fēng)病人體內(nèi)尿酸的合成速度加快。另外，鳥(niǎo)氨酸的顯著升高說(shuō)明痛風(fēng)病人的尿素循環(huán)也發(fā)生異常。

本研究中，痛風(fēng)病人血清中多種有機(jī)酸的水平明顯上調(diào)，其中3-羥基-3-甲基丁酸(HMB)是亮氨酸的活性代謝產(chǎn)物，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充HMB會(huì)導(dǎo)致膠原沉積，臨床樣本實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，且主要表現(xiàn)為羥脯氨酸含量升高[21]。血清中羥脯氨酸含量上升則與體內(nèi)結(jié)締組織增生或破壞密切相關(guān)，而痛風(fēng)的主要特征正是尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)、腎及周圍結(jié)締組織中沉積引發(fā)炎癥。2,3-二羥基丁酸是蘇氨酸的代謝產(chǎn)物[22]。蘇氨酸是人體必需氨基酸，是一種生糖氨基酸，而亮氨酸作為支鏈氨基酸，在機(jī)體能量供應(yīng)中也起著重要作用，它們下游產(chǎn)物的增加提示痛風(fēng)病人能量消耗可能增加。研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激在高尿酸血癥的形成中起重要作用[23]。蘇糖酸是抗壞血酸的主要代謝產(chǎn)物，而L-抗壞血酸是反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的代謝物[24]；本研究中蘇糖酸呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，說(shuō)明痛風(fēng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。肌醇與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的氧化有關(guān)，所以肌醇的升高可能會(huì)加劇能量代謝和脂代謝異常[25]。

表1　鑒定得到的痛風(fēng)病人和健康人的血清差異代謝物

*:p<0.05,** :p<0.01

圖4　重要差異代謝物在相關(guān)代謝通路中的變化

一碳單位是嘌呤、嘧啶的合成原料，甘氨酸分解代謝是體內(nèi)一碳單位的主要來(lái)源。甘氨酸水平的下降可能是由于甘氨酸分解代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致痛風(fēng)病人體內(nèi)嘌呤合成增加，引發(fā)嘌呤代謝紊亂。肥胖是痛風(fēng)發(fā)病的一個(gè)重要相關(guān)因素，在肥胖癥患者體內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)?；撬崴浇档蚚26]。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)?；撬嵊锌寡譡27]、抗氧化[28]及改善胰島素敏感性[29]的作用，在本研究中明顯下降的亞?；撬崾桥；撬岷铣傻那绑w物質(zhì)，這部分解釋了痛風(fēng)患者并發(fā)肥胖及糖尿病的原因。甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸的顯著下調(diào)則說(shuō)明痛風(fēng)病人體內(nèi)脂類代謝水平下降。

3結(jié)論

利用GC-MS對(duì)痛風(fēng)病人及健康人的血清進(jìn)行了代謝輪廓分析。利用多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示痛風(fēng)病人與健康人的血清代謝圖譜有明顯的差異，并鑒定出22個(gè)差異代謝物。與健康人相比，痛風(fēng)病人核苷酸代謝、糖代謝及氨基酸代謝呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，而脂類代謝則有明顯下降。本研究證明GC-MS是進(jìn)行疾病血清特征分析的有效手段，鑒定的差異代謝物有望成為潛在的生物標(biāo)志物，并為痛風(fēng)的臨床診斷及機(jī)制的深入研究提供參考依據(jù)。

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Analysis of Serum Metabolic Characteristics in Patients with Gout Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Jiao1,ZHOU Jia1,WEI Shuang-shuang1,LI Hai-chang1,WEN Cheng-ping1*，XU Guo-wang2*

(1.College of Basic Medical,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou310053,China;2.CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian116023,China)

Abstract：Gout is a highly heterogeneous disease which occurs only in human being,it would cause gouty arthritis,and even lead to disability.There could be obvious alterations of metabolites in the serum of the patient with gout,and the discovery of metabolic characteristics may be helpful for the clinical diagnosis and treatment of gout.A gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) based metabolic profiling method was employed to analyze the distinctive metabolic patterns of serum in gout patients.Serum samples collected from 29 gout patients and 26 healthy controls were analyzed.The principal component analysis(PCA) and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) were used to assess the metabolic data.Marked differences between gout patients and healthy controls were shown in PCA score plot.Variable importance for project values(VIP) and Student’s t-test were combined to pick out the significant metabolic changes.Compared with that of the control group,the serum metabolic characteristics of the gout group were featured by increased levels of metabolites related to nucleotide metabolism(hypoxanthine,uric acid and uridine),carbohydrate metabolism(2,3-dihydroxybutyrate,D-threitol,D-gluconic acid,myo-inositol,etc.) and amino acid metabolism(3-hydroxy-3-methylbutyrate,L-ornithine and indole-3-lactic acid),decreased levels of lipids(monoethanolamine,glycerol,glyceric acid,etc.),glycine and hypotaurine.The preliminary results suggest that GC-MS based metabolic profiling method appears to be a useful tool in the exploration of the serum metabolic characteristics of gout.These revealed disease-associated metabolic perturbations involved in multiple metabolic pathways including purine metabolism and the urea cycle,which could help to elucidate the pathogenesis of gout and provide a potential aid for the accurate diagnosis or treatment of gout.

Key words：gout；metabolomics；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；serum

中圖分類號(hào)：O657.63;S852.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)02-0137-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.003

*通訊作者：許國(guó)旺，博士，研究員，研究方向：代謝組學(xué)分析技術(shù)平臺(tái)及其在疾病、中藥、植物表型、食品安全等方面應(yīng)用的研究，Tel：0411-84379530,E-mail：xugw@dicp.ac.cn

基金項(xiàng)目：浙江省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目-分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37045)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81403269)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目973計(jì)劃(2014CB543001)

收稿日期：2015-08-17；修回日期：2015-10-19

溫成平，博士，教授，研究方向：免疫風(fēng)濕病的中醫(yī)臨床基礎(chǔ)治法與臨床研究,Tel：0571-86613131,E-mail：wengcp@163.com