張龍玉，孫穎，黃昂，郝書理，李保森，張紀(jì)元，鄒正升

·酒精性肝病·

酒精性肝病患者肝組織NLRP3炎癥復(fù)合體基因水平檢測(cè)及其意義*

張龍玉，孫穎，黃昂，郝書理，李保森，張紀(jì)元，鄒正升

目的探討核苷酸結(jié)合性寡聚區(qū)蛋白樣受體（NLR）P3炎癥復(fù)合體在酒精性肝病（ALD）發(fā)病中的作用。方法本研究獲得酒精性肝炎（AH）12例、酒精性肝硬化（ALC）4例和健康人（HC）12例肝組織，采用RT-PCR法檢測(cè)肝組織NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA水平。采集ALD患者84例【AH20例、ALC48例（Child-Pugh A級(jí)19例、B級(jí)22例和C級(jí)7例）和重癥酒精性肝炎（SAH）16例】和健康人40例血漿，采用ELISA法檢測(cè)血漿IL-1β水平，采用Spearman秩相關(guān)分析血漿IL-1β水平與臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果AH和ALC患者肝組織NLRP3 mRNA水平分別為（28.1±2.8）和（28.4±3.1），均顯著高于HC組【（8.8±1.8），P＜0.001】，Caspase-1 mRNA水平分別為（18.8±1.2）和（24.6±1.8），均顯著高于HC組【（15.1±1.0），P＜0.05】，IL-1βmRNA水平分別為（17.0±2.9）和（16.3±4.4），均顯著高于HC組【（7.0±1.1），P＜0.01】；肝組織NLRP3 mRNA水平分別與IL-1βmRNA或Caspase-1 mRNA水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；AH、ALC和SAH患者血漿IL-1β水平分別為（36.1± 1.8）pg/mL、（28.0±1.6）pg/mL和（32.5±2.4）pg/mL，均顯著高于HC組【（14.7±0.8）pg/mL，P＜0.01】；不同Child-Pugh分級(jí)ALC患者IL-1β水平無顯著性差異（P＞0.05）；ALD患者血漿IL-1β水平與ALT和AST/ALT比值呈正相關(guān)。結(jié)論NLRP3炎癥復(fù)合體主要組分及促炎細(xì)胞因子IL-1β在ALD患者肝組織和血漿水平升高，可能參與了ALD發(fā)病的炎癥反應(yīng)過程。

酒精性肝??；核苷酸結(jié)合性寡聚區(qū)蛋白樣受體P3炎癥復(fù)合體；Caspase-1；白介素-1β

屬于核苷酸結(jié)合性寡聚區(qū)蛋白樣受體（Nucleotide-binding and oligomerization domainlike receptors，NLRs）家族的NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣CARD區(qū)的蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和胱天蛋白酶前體（Pro-caspase-1）共同構(gòu)成NLRP3炎癥復(fù)合體[1～4]。NLRP3是NLRs家族的重要成員之一[5，6]，作為胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs）能感知病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)（Endogenous danger signals，DAM Ps），進(jìn)而啟動(dòng)炎癥復(fù)合體激活[7]。NLRP3的核苷酸結(jié)合性寡聚結(jié)構(gòu)域（Nucleotide binding domain，NBD，又稱NACHT區(qū)）通過介導(dǎo)自身寡聚化招募ASC和Pro-caspase-1，將Pro-caspase-1剪接為胱天蛋白酶（Caspase-1）。促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β前體（Pro-IL-1β）在Caspase-1的作用下生成具有活性的IL-1β，并釋放到胞外，引起炎癥反應(yīng)[8～10]。目前已經(jīng)證實(shí)NLRP3炎癥復(fù)合體與許多疾病相關(guān)，而其與ALD發(fā)病的關(guān)系，到目前為止還不是很明確。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)了ALD患者和健康人肝組織NLRP3炎癥復(fù)合體mRNA水平，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象2015年1月至8月于我中心住院治療的酒精性肝炎（Alcoholic hepatitis，AH）12例、酒精性肝硬化（Alcoholic liver cirrhosis，ALC）4例患者的肝組織（主要來自肝臟穿刺活檢術(shù)或因肝硬化行脾切除時(shí)所取得的少許肝組織）和健康對(duì)照（Health control，HC）12例肝組織（主要來自肝移植手術(shù)時(shí)正常肝組織或因血管瘤手術(shù)切除血管瘤時(shí)所取得的少許肝組織），均為男性。同時(shí)留取ALD患者血漿84例，其中AH患者20例、ALC患者48例（Child-Pugh A級(jí)19例、B級(jí)22例和C級(jí)7例）和重癥酒精性肝炎（Severe alcoholic hepatitis，SAH）患者16例，均為男性。診斷參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年修訂的《酒精性肝病診療指南》[1]。排除HBV、HCV和HIV感染、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、肝臟原發(fā)性或繼發(fā)性惡性腫瘤、孕婦以及合并嚴(yán)重的心、腦、血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病者。同時(shí)抽取40例男性HC血漿作為對(duì)照。各組在年齡、性別等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間均衡性好，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。研究對(duì)象基線資料見表1。

1.2 肝組織有關(guān)基因mRNA測(cè)定提取新鮮肝組織總RNA，試劑盒購自Axygen公司（SFO，USA）。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，試劑盒購自Promega公司（Wisconsin，USA）。采用RT-PCR法對(duì)NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購自博日科技（杭州，中國）。引物序列見表2，引物由賽百盛（上海，中國）合成。所得mRNA水平=2-△CT（△CT=目的基因的CT值-GAPDH的CT值）。

表1 研究對(duì)象臨床資料（±s）

表1 研究對(duì)象臨床資料（±s）

①中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值

HC（n=40）AH（n=20）ALC（n=48）SAH（n=16）年齡（歲）44.3±1.9 45.3±2.0 50.4±1.0 49.5±0.6飲酒時(shí)間（年）16.1±1.4 21.8±1.0 21.1±0.6日飲酒精量（g）117.3±13.7 100.3±4.5 102.3±3.0 NLR①1.9±0.2 2.1±0.3 2.7±0.2 2.9±0.2 ALB(g/L)42.1±1.6 40.9±1.2 31.2±0.7 32.2±0.5 TBIL(μmol/L)10.6±3.1 55.5±19.7 44.9±3.8 59.6±4.8 ALT(U/L)19.6±1.2 89.0±12.8 40.2±4.6 55.8±5.3 AST(U/L)23.1±2.9 96.4±16.1 57.1±4.6 64.9±3.8 ALP(U/L)56.8±4.1 134.2±17.2 117.5±11.1 123.8±7.1 PTA(%)96.1±2.1 92.6±4.9 64.1±2.0 38.2±1.5 INR 0.9±0.3 1.0±0.1 1.3±0.0 1.3±0.0

1.3 血清IL-1β檢測(cè)清晨空腹采集靜脈血，分離血漿，凍存于-80℃低溫冰箱備測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)血漿IL-1β水平（eBioscience公司，Santiago，USA，檢測(cè)范圍為0～720 pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為＜5%和＜10%），所有標(biāo)本被重復(fù)檢測(cè)2次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Windows系統(tǒng)SPSS 19.0（SPSS Inc.Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，同組間比較采用Wilcoxon rank檢驗(yàn)，不同組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同組肝組織NLRP3、Caspase-1和IL-1βmR -NA水平比較AH和ALC患者肝組織NLRP3 mRNA水平均顯著高于HC（P＜0.001），而AH與ALC患者之間無顯著性差異（圖1A）；肝組織Caspase-1 mRNA水平均顯著高于HC（P＜0.05），三組肝組織Caspase-1 mRNA水平之間均有顯著性差異（P＜0.05，圖1B）；肝組織IL-1βmRNA水平均顯著高于HC（P＜0.01），而AH組與ALC組之間無顯著性差異（圖1C，表3）。

表3 3組肝組織NLRP3、Caspase-1和IL-1β m RNA水平（±s）比較

表3 3組肝組織NLRP3、Caspase-1和IL-1β m RNA水平（±s）比較

與HC組比，①P＜0.05;與AH組比，②P＜0.05

圖1 A 3組肝組織NLRP3 mRNA水平比較

圖1 B 3組肝組織Caspase-1 mRNA水平比較

圖1 C 3組肝組織IL-1βmRNA水平比較

2.2 相關(guān)性分析對(duì)HC和ALD肝組織NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA和IL-1βmRNA水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肝臟組織NLRP3 mRNA與IL-1βmRNA水平呈正相關(guān)（r=0.451，P＜0.001，圖2A）；NLRP3 mRNA與Caspase-1 mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.162，P＜0.05，圖2B）；Caspase-1 mRNA與IL-1βmRNA水平無相關(guān)（r=0.080，P＞0.05，圖2C）。

圖2 A肝組織NLRP3與IL-1βmRNA水平的相關(guān)性分析

圖2 B肝組織NLRP3與Caspase-1 mRNA水平的相關(guān)性分析

圖2 C肝組織Caspase-1與IL-1βmRNA水平的相關(guān)性分析

2.3 血漿IL-1β水平比較AH（n=20）、ALC（n=48）和SAH（n=16）患者外周血血漿IL-1β水平分別為（36.1±1.8）pg/mL、（28.0±1.6）pg/mL和（32.5± 2.4）pg/mL，均顯著高于HC組（n=40）【（14.7±0.8）pg/mL，P＜0.001，圖3A】；Child-Pugh A級(jí)（n=19）、B級(jí)（n=22）和C級(jí)（n=7）ALC患者血漿IL-1β水平分別為（27.5±2.8）pg/mL、（29.9±7.5）pg/mL和（21.1±4.2）pg/mL，3組之間無顯著性差異（P＞0.05，圖3B）。

圖3 A不同組血漿IL-1β水平比較

圖3 B不同Child-Pugh分級(jí)ALC患者血漿IL-1β水平比較

2.4 血漿IL-1β水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析84例ALD患者血漿IL-1β水平與血清ALT（r=0.258，P＜0.05，圖4A）和AST/ALT比值（r=-0.374，P＜0.05，圖4B）呈正相關(guān)，而與NLR、ALB、TBIL、AST、ALP、PTA和INR無顯著相關(guān)性。

圖4 A血漿IL-1β與ALT水平的相關(guān)性

圖4 B血漿IL-1β與AST/ALT比值的相關(guān)性

3 討論

2002年，Martinon研究證實(shí)NLRP1能夠與相關(guān)分子相互作用，形成大型蛋白復(fù)合體，即炎癥復(fù)合體，從而活化Caspase-1，促進(jìn)pro-IL-1β分子的成熟和釋放[5，11]。NLRs是胞漿內(nèi)具有信號(hào)傳導(dǎo)功能的PRRs，與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）一樣，都是天然免疫系統(tǒng)對(duì)PAMPs和DAMPs識(shí)別的重要感受器。NLRP3作為NLRs家族中的一員，主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等[12～14]。NLRP3蛋白分子與ASC分子和pro-Caspase-1共同構(gòu)成NLRP3炎癥復(fù)合體。激活的NLRP3炎癥復(fù)合體能促使caspase-1活化,進(jìn)而促進(jìn)pro-IL-1β的成熟和分泌[15，16]。近年來，NLRP3炎癥小體在相關(guān)疾病中的作用引起了人們的關(guān)注。目前已經(jīng)證實(shí)2型糖尿病、肥胖、痛風(fēng)、阿爾茨海默病和克羅恩病等的發(fā)生與NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)[17～19]。

NLRP3炎癥復(fù)合體的激活在ALD動(dòng)物模型研究中被證實(shí)是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、免疫細(xì)胞激活和肝臟炎癥放大的原因之一。最近，Petrasek et al對(duì)NLRP3炎癥復(fù)合體在酒精性肝炎中的作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)ALD小鼠肝內(nèi)NLRP3炎癥復(fù)合體的組分ASC、Caspase-1和效應(yīng)因子IL-1β顯著增加，而給小鼠體內(nèi)注射重組IL-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）阿那白滯素（Anakinra）可以減輕IL-1信號(hào)途徑激活造成的ALD，提示重組IL-1Ra具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[20]。NLRP3炎癥復(fù)合體與酒精性肝病患者肝內(nèi)炎癥、脂肪變和纖維化程度的關(guān)系還不是很明確，仍存有很大的研究空間。

本實(shí)驗(yàn)以臨床ALD患者為研究對(duì)象，探討了NLRP3炎癥復(fù)合體信號(hào)通路及其相關(guān)分子與ALD發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ALD患者肝組織NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA和IL-1βmRNA水平均顯著高于HC組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。NLRP3 mRNA與IL-1βmRNA（r=0.451，P＜0.001）、NLRP3 mRNA與Caspase-1 mRNA（r=0.162，P＜0.05）均呈正相關(guān)。AH、ALC和SAH患者血漿IL-1β水平分別為（36.1±1.8）pg/m l、（28.0±1.6）pg/ml和（32.5±2.4）pg/ml，顯著高于HC組[（14.7±0.8）pg/ml，P＜0.001]，但不同Child-Pugh分級(jí)ALC患者血漿IL-1β水平無顯著差異（P＞0.05）。在與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析中，ALD患者血漿IL-1β水平與ALT（r=0.258，P＜0.05）和AST/ALT比值（r=-0.374，P＜0.05）呈正相關(guān)。

NLRP3炎癥復(fù)合體主要組分和促炎細(xì)胞因子IL-1β在ALD患者肝組織和血漿水平升高，提示NLRP3炎癥復(fù)合體可能參與了ALD患者肝內(nèi)炎癥反應(yīng)過程，在ALD炎癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，但其具體的相互作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡述。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南.中華肝臟病雜志，2010，18（3）:167-171.

[2]王曉霞，李保森.2002至2011年中國“北方”地區(qū)住院肝硬化患者病因構(gòu)成及變化趨勢(shì)分析.實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（2）: 154-158.

[3]鄒正升，王曉霞.住院的酒精性肝病患者臨床疾病特點(diǎn)分析.實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（1）:26-29.

[4]Martinon F，Burns K，Tschopp J，et al.The inflammasome:a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.Mol Cell，2002，10（2）: 417-426.

[5]Akira S US，Takeuch I.Pathogen recognition and innateimmunity. Cell，2006，124（4）:783-801.

[6]Tschopp J.NALPs:a novel protein family involved in inflammation.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（2）:95-104.

[7]Cassel SL，Joly S，Sutterwala FS，et al.The NLRP3 inflammasome: a sensor of immune danger signals.Semin Immunol，2009，21（4）: 194-198.

[8]Albano E，Vidali M.Immune mechanisms in alcoholic liver disease.Genes Nutr，2010，5:141-147.

[9]Szabo G，Csak T.Inflammasomes in liver diseases.J Hepatol，2012，57（3）:642-654.

[10]Gross O，Thomas CJ，Guarda G，et al.The inflammasome:an integrated view.Immunol Rev，2011，243（1）:136-151.

[11]Szabo G，Petrasek J.Inflammasome activation and function in liver disease.Nature Rev Gastroenterol Hepatol，2015，12: 387-400.

[12]Lippai D，Bala S，Petrasek J，et al.Alcohol-induced IL-1 in the brain is mediated by NLRP3/ASC inflammasome activation that amplifies neuroinflammation.J Leukoc Biol，2013，94:171-182.、

[13]Ayna G，Krysko DV，Kaczmarek A，et al.ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages.PLoSOne，2012，7（6）:e40069.

[14]Zhou1 R，Yazdi1 AS，Menu1 P，et al.A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation.Nature，2011，469:221-226.

[15]Petrasek J，Bala S，Csak T，et al.IL-1 receptor antagonist ameliorates inflammasome-dependent alcoholic steatohepatitis in mice.JClin Invest，2012，122（10）:3476-3489.

[16]Peng Y，F(xiàn)rench BA，Tillman B，et al.The inflammasome in alcoholic hepatitis:Its relationship with Mallory-Denk body formation.Ex p Mol Pathol，2014，97（2）:305-313.

[17]Larsen CM，F(xiàn)aulenbach M，Vaag A，et al.Interleukin-1-receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus.Medication，2007，356: 1517-1526.

[18]McGonagle D，Tan AL，Madden J，et al.Successful treatment of resistant pseudogout with anakinra.Arthritis Rheum，2008，58（2）:631-633.

[19]So A，De Smedt T，Revaz S，et al.A pilot study of IL-1 inhibition by anakinra in acute gout.Arthritis Res Ther，2007，9（2）:R28.

[20]Bauernfeind F，Ablasser A，Bartok E，et al.Inflammasomes: current understanding and open questions.Cell Mol Life Sci，2011，68（5）:765-783.

（收稿：2015-12-02）

（本文編輯：陳從新）

Role of nucleotide-binding and oligom erization dom ain-like recep tors P3 inflamm asome in patients with alcoho licliverd iseases

Zhang Longyu，Sun Ying，Huang Ang，et al.
Center for Diagnosis and Treatment of Non-Infectious Liver Disease，302nd Hospital，Beijing 100039，China

Objective To explore the role of nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors（NLR）P3 inflammasome in patients with alcoholic liver diseases（ALD）.M ethods The liver tissues from 12 patients with alcoholic hepatitis（AH），4 with alcoholic liver cirrhosis（ALC）and 12 healthy persons were obtained in this study，and NLRP3，Caspase 1 and IL-1 beta mRNA levels were detected by RT-PCR.Plasma IL-1βlevels were assayed by ELISA in 84 patients with ALD[20 with AH，48 with ALC（19 with Child-Pugh class A，22 with class B and 7 with class C），16 with severe alcoholic hepatitis（SAH）and 40 healthy persons.The correlation of plasma IL-1βlevel to biochemical indexes was analyzed.Resu lts The hepatic NLRP3 mRNA levels in patients with AH and ALC were（28.1±2.8）and（28.4±3.1），significantly higher than that in healthy control[（8.8±1.8），P＜0.01]，the Caspase-1 mRNA levels were（18.8±1.2）and（24.6±1.8），significantly higher than that in healthy persons[（15.1±1），P＜0.05]，IL-1βmRNA levels were（17.0±2.9）and（16.3±4.4），significantly higher than that in healthy control[（7.0±1.1），P＜0.01]，and NLRP3 mRNA levels was positively correlated to IL-1βmRNA or Caspase 1 mRNA（P＜0.05）；plasma IL-1βlevels in patients with AH，ALC and SAH were（36.1±1.8） pg/mL，（28.0±1.6）pg/m l and（32.5±2.4）pg/m l，respectively，significantly higher than that in healthy persons[（1.5±0.8）pg/ml，P＜0.01]；the plasma IL-1β levels in patients with Child-Pugh class A，B and C had no significant difference（P＞0.05）；plasma IL-1β level in patients with ALD was positively correlated to serum ALT or the ratio of AST/ALT.Conclusion NLRP3 inflammasome and proinflammatory cytokinesIL-1βare involved in patients with ALD，and they might play an important roles in liver inflammatory process.

Alcoholic liver diseases；Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors P3；Caspase-1；Interleukin-1β

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.010

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81370530，8157 041750）

100039北京市北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部教學(xué)醫(yī)院/解放軍第302醫(yī)院非感染性肝病診療中心（張龍玉，孫穎，黃昂，郝書理，李保森，鄒正升）；肝病生物治療研究中心（張紀(jì)元）

張龍玉，女，27歲，碩士研究生。主要從事酒精性肝病致病機(jī)制與治療學(xué)研究。E-mail:zhly302@163.com

鄒正升，E-mail:zszou302@163.com