田保華，張彥潔，張麗萍，馬曉麗，金竹萍，劉志強(qiáng)，劉旦梅，裴雁曦（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006）

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鎘/鉻脅迫對谷子幼苗生長和NADPH氧化酶及抗氧化酶體系的影響

田保華，張彥潔，張麗萍，馬曉麗，金竹萍，劉志強(qiáng)，劉旦梅，裴雁曦*
（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006）

摘要：為了探討重金屬鎘（Cd）、鉻（Cr）脅迫對谷子幼苗生長和生理的影響，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法,檢測不同濃度的Cd、Cr脅迫對谷子幼苗生長以及過氧化氫（H2O2）含量、葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、NADPH氧化酶和抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明：不同濃度（50/1000 μmol·L-1）兩種金屬（Cd、Cr）脅迫下，谷子幼苗株高、根長顯著減?。≒＜0.05），H2O2和MDA含量升高，葉綠素含量降低；隨Cd、Cr的濃度升高，根和葉片中NADPH氧化酶活性顯著增強(qiáng)，高濃度Cd、Cr可導(dǎo)致過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性顯著升高；同時Cd、Cr誘導(dǎo)編碼NADPH氧化酶基因Sirboh D和Sirboh F的表達(dá)，而超氧化物歧化酶（SOD）活性呈低濃度增加高濃度下降的趨勢。由此可知，Cd、Cr對谷子幼苗的脅迫使其發(fā)生一系列生理指標(biāo)變化，造成植株不同程度損傷，植株自身則通過增強(qiáng)抗氧化酶活性對機(jī)體起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：鎘；鉻；NADPH氧化酶；谷子

田保華，張彥潔，張麗萍,等.鎘/鉻脅迫對谷子幼苗生長和NADPH氧化酶及抗氧化酶體系的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35（2）：240-246.

重金屬鎘（Cadmium, Cd）和鉻（Chromium, Cr）是生物非必需金屬元素，由于工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)實(shí)踐，許多農(nóng)田受其污染[1]，重金屬通過作物根部吸收并傳輸?shù)襟w內(nèi)，可造成幼葉失綠、植株矮小、根損傷等中毒癥狀，嚴(yán)重時直接導(dǎo)致死亡[2]。Cd、Cr對植物的毒性誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[3-4]，這是一個復(fù)雜的脅迫響應(yīng)過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些作物受到Cd或Cr脅迫時，產(chǎn)生大量過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）并增強(qiáng)膜脂質(zhì)過氧化作用[5-6]。而質(zhì)膜NADPH氧化酶是最重要的H2O2酶源，它將電子從細(xì)胞質(zhì)的NADPH轉(zhuǎn)移給O2形成O-2·，隨后又生成H2O2和·OH[7]，且NADPH氧化酶在植物生長發(fā)育、防衛(wèi)和響應(yīng)金屬（包括Cu、Fe、Zn、Cd）缺乏或過量等過程中起重要作用[8-11]。

谷子[Setaria italica（L.）P. Beauv.]是我國北方重要谷類作物，具有耐逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特性。2012年，Nature雜志發(fā)表兩篇谷子全基因組序列文章，加快了谷子抗逆機(jī)制的研究步伐[12-13]。國內(nèi)外有關(guān)重金屬對谷子生長發(fā)育毒害作用的報道甚少，研究發(fā)現(xiàn)在Pb、Cu脅迫下不同基因型谷子幼苗的DNA穩(wěn)定性、生長狀態(tài)和吸收積累存在差異[14-15]，而Cd、Cr脅迫對谷子幼苗的毒理效應(yīng)和NADPH氧化酶的影響目前還未見報道。本文在實(shí)驗(yàn)室條件下，研究了高/低濃度Cd、Cr脅迫對谷子幼苗生長狀態(tài)、H2O2、葉綠素、丙二醛含量和NADPH氧化酶及ROS相關(guān)酶活性的影響，旨在探討谷子響應(yīng)重金屬脅迫的機(jī)理。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試谷子品種為晉谷21號，購買于山西省農(nóng)科院谷子所。

1.2試驗(yàn)設(shè)計

種子經(jīng)75%的乙醇溶液消毒1 min，6%的次氯酸鈉消毒10 min，用去離子水沖洗3次，23℃黑暗浸泡24 h。然后播種于鋪有三層紗布的有蓋培養(yǎng)皿中，于23℃黑暗萌發(fā)2 d后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)條件（光強(qiáng)度160 μE·m-2·s-1，光暗周期16 h/8 h，相對濕度60%）進(jìn)行以下不同的處理：

種子萌發(fā)2 d后，用10 mL不同濃度的鎘（0、50、1000 μmol·L-1CdCl2）或鉻（0、50、1000 μmol·L-1K2Cr2O7）的1/4 Hoagland營養(yǎng)液處理幼苗，每天更換1次處理液，生長7 d后測定其株高、根長、H2O2含量、葉綠素含量及MDA含量。

種子萌發(fā)2 d后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)條件下生長，每天更換1次營養(yǎng)液，7 d后用10 mL不同濃度的鎘（0、50、1000 μmol·L-1）或鉻（0、50、1000 μmol·L-1）的1/4 Hoagland營養(yǎng)液處理幼苗24 h，檢測rboh D/F （Sirboh D/F）基因的表達(dá)水平和NADPH氧化酶及ROS相關(guān)酶的活性。

1/4 Hoagland營養(yǎng)液為硝酸鈣945 mg·L-1、硝酸鉀607 mg·L-1、磷酸銨115 mg·L-1、硫酸鎂493 mg· L-1、鐵鹽溶液2.5 mL·L-1、微量元素5 mL·L-1，pH6.0。

1.3測定項(xiàng)目與方法

1.3.1生理參數(shù)

谷子幼苗整株取出，蒸餾水沖洗后，測量幼苗的株高、根長（以20株幼苗平均值計，mm）。葉綠素含量采用96%乙醇提取法測定[16]。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定[17]。H2O2含量通過檢測過氧化鈦復(fù)合物在410 nm的吸光值計算[18]。

1.3.2酶活的測定

分別提取谷子幼苗葉片和根的粗酶液，5000 r· min-1離心3 min，取上清液測定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，EC 1.15.1.1），過氧化物酶（Peroxidase，POD，EC 1.11.1.7），過氧化氫酶（Catalase，CAT，EC 1.11.1.6）和抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX，EC 1.11.1.11）的活性。酶活測定參照Lata等[19]的方法；NADPH氧化酶活性的測定參照GENMED試劑盒（杰美基因GMS50096.3）。

1.3.3葉片H2O2定位

取適量二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）染液（1% DAB溶于10 mmol·L-1MES緩沖液，pH 6.5）加入預(yù)處理的葉片，28℃避光保存8 h，蒸餾水沖洗3次，加入無水乙醇沸水浴直到葉片完全脫色為止；再次更換無水乙醇，置4℃冰箱保存一段時間后觀察并拍照[3]。

1.3.4根細(xì)胞死亡檢測

不同處理的谷子幼苗離體根尖用蒸餾水沖洗后，置于0.25%（W/V）伊文思藍(lán)溶液染色5 min，然后再用蒸餾水沖洗3次，制片觀察并拍照[3]。

1.3.5 NADPH氧化酶編碼基因rboh D/F的qRT-PCR分析

取適量不同處理的谷子幼苗葉片和根，用RNAiso Plus提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，用2-△△Ct法分析基因表達(dá)水平。qRT-PCR特異性引物見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司（Sangon）合成。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用3個生物學(xué)重復(fù)的平均值，差異顯著性分析采用SPSS 13.0（IBM，New York，USA）軟件進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，然后用SigmaPlot 10.0（Systat Software Inc.，London，UK）軟件作圖。

表1　 qRT-PCR特異性引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

2　結(jié)果與分析

2.1高/低濃度Cd、Cr對谷子幼苗生長表型的影響

圖1A顯示，萌發(fā)一致的谷子幼苗經(jīng)低濃度（50 μmol·L-1）的Cd、Cr處理7 d后，與對照組相比，幼苗變矮，根變短；高濃度（1000 μmol·L-1）的Cd、Cr顯著抑制幼苗植株和根的生長，導(dǎo)致植株矮小、葉片卷曲、根減小。統(tǒng)計分析（表2）可知，Cd、Cr處理后谷子幼苗株高和根長顯著減小（P＜0.05）。葉片中過氧化氫DAB染色表明，低濃度的Cd、Cr誘導(dǎo)紅褐色斑點(diǎn)產(chǎn)生于葉尖和葉脈，而高濃度的Cd、Cr處理使整個葉片產(chǎn)生大面積斑點(diǎn)（圖1B）。與對照組相比，不同濃度的Cd、Cr均可顯著誘導(dǎo)谷子幼苗產(chǎn)生H2O2（表2）。在根尖染色觀察發(fā)現(xiàn)，與低濃度處理相比，高濃度Cd、Cr脅迫后根尖細(xì)胞染色較深（圖1C）。

表2　鎘、鉻處理下谷子幼苗的株高、根長、過氧化氫含量Table 2 Plant height，root length，and H2O2concentration of foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments

2.2高/低濃度Cd、Cr對谷子幼苗生理的影響

與對照組相比，高濃度Cd、Cr使根中的MDA含量顯著升高（P＜0.05），低濃度脅迫也可導(dǎo)致根中MDA含量升高，但差異不顯著；而葉片中高/低濃度Cd、Cr處理后MDA含量都升高，但只有高濃度Cr處理后具有顯著差異性（P＜0.05）。與對照組相比（表3），葉綠素含量隨著重金屬Cd、Cr濃度的升高而下降，具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1　鎘、鉻對谷子生長影響Figure 1 Effects of Cd or Cr stresses on plant growth

2.3 Cd、Cr對谷子幼苗中SOD酶和NADPH氧化酶的影響

與對照組相比，7 d谷子幼苗經(jīng)高/低濃度的Cd、Cr處理24 h后，SOD活性增強(qiáng)。在葉片中，低濃度Cd、Cr顯著誘導(dǎo)SOD活性升高；而在幼苗根中，高濃度的Cd、Cr處理顯著抑制SOD活性（圖2）。在葉片中，低濃度Cd、Cr顯著抑制NADPH氧化酶的活性，而高濃度Cd、Cr處理顯著增強(qiáng)NADPH氧化酶的活性（P＜0.05，圖3A）；在根中，各濃度的Cd、Cr均可誘導(dǎo)NADPH氧化酶活性升高，高濃度Cd、Cr處理誘導(dǎo)作用強(qiáng)于低濃度（圖3B）。

表3　鎘、鉻處理下谷子幼苗的總?cè)~綠素和丙二醛含量Table 3 Chlorophyll and MDA concentrations of foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments

2.4 Cd、Cr對NADPH氧化酶轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過檢測NADPH氧化酶編碼基因的表達(dá)可知，rboh D（Sirboh D）和rboh F（Sirboh F）兩個基因在谷子幼苗葉片和根中均有表達(dá)。與對照相比，高濃度Cd處理后根部rboh D表達(dá)量增多，低濃度Cd處理后幼苗根和葉片中rboh D基因的表達(dá)下調(diào)；Cr處理后葉片和根中rboh D表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖4A）。與對照相比，在低濃度Cd處理后編碼NADPH氧化酶的rboh F在葉片和根中的表達(dá)下調(diào)，在葉片中，高濃度的Cd誘導(dǎo)rboh F基因表達(dá)上調(diào)，差異顯著；不同濃度Cr處理幼苗后，rboh F基因在葉片和根中表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖4B）。

圖2　鎘、鉻對谷子SOD活性影響Figure 2 Effects of Cd or Cr stresses on SOD activity

圖3　鎘、鉻對谷子NADPH氧化酶活性影響Figure 3 Effects of Cd or Cr stresses on NADPH oxidase activity

2.5 Cd、Cr對谷子幼苗抗氧化酶活性的影響

與對照組相比，Cd、Cr處理均可使谷子幼苗葉片和根中POD、CAT和APX活性增強(qiáng)（表4）。在根中Cd、Cr誘導(dǎo)POD活性高于葉片，而葉片中POD活性隨Cd濃度增大顯著升高（P＜0.05）；CAT活性在葉片和根中均隨重金屬濃度的升高而升高；在葉片中，高濃度Cd、Cr處理均可使APX活性顯著升高，在根中，高/低濃度Cd誘導(dǎo)APX的活性顯著升高（P＜0.05），而Cr僅在高濃度時誘導(dǎo)APX活性升高（P＜0.05）。

圖4　鎘、鉻對谷子NADPH氧化酶編碼基因表達(dá)量影響Figure 4 Effects of Cd or Cr stresses on NADPH oxidase encoding genes

表4　鎘、鉻處理下谷子幼苗中抗氧化酶的活性（U·mg-1protein）Table 4 Activities of anti-oxidative enzymes in foxtail millet seedlings with Cd or Cr treatments（U·mg-1protein）

3　討論

植物在環(huán)境中往往受到各種不利因素的脅迫，如干旱、鹽、極端溫度和重金屬等，在長期進(jìn)化過程中作物會形成不同的反應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對這些脅迫，同時產(chǎn)生多種中毒癥狀，包括葉片變形[17]、葉片失綠、根變短、生長與發(fā)育受到抑制[2]等。本研究證實(shí)重金屬Cd、Cr對谷子幼苗的根系與葉片的發(fā)育產(chǎn)生類似的影響，同時誘發(fā)植物產(chǎn)生一系列的生理變化。NADPH氧化酶可通過自身的激活或失活迅速引起ROS的升高或降低，由此產(chǎn)生的ROS充當(dāng)信號分子來激活機(jī)體應(yīng)答脅迫，可見NADPH氧化酶在作物生長與發(fā)育中起重要作用[8]。近來的研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶與Cd及Cr重金屬脅迫關(guān)系密切，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cd抑制葉片中NADPH氧化酶活性，該結(jié)果與Groppa 等[20]用0.1 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1Cd處理向日葵（Helianthus annuus L.）葉片后NADPH氧化酶活性變化一致。高濃度Cr處理谷子幼苗后，葉片和根中NADPH氧化酶的活性升高，Pandey等[4]研究發(fā)現(xiàn)六價Cr處理豌豆（Pisum sativum L.cv. Azad）根可導(dǎo)致NADPH氧化酶的迅速增高，其機(jī)理可能是重金屬離子與Ca2+競爭性的結(jié)合到NADPH氧化酶的EF-hand結(jié)構(gòu)域，從而影響酶的活性，損害根質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，降低光合作用且阻礙生長[20]。Fang等[17]研究發(fā)現(xiàn)Cr影響體內(nèi)Ca2+的含量，從而激活谷子編碼鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鈣受體基因的表達(dá)。植物NADPH氧化酶被預(yù)測含有6個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，包含2個血紅素結(jié)合位點(diǎn)、位于C-端的NADPH和FAD結(jié)合位點(diǎn)與N-端2個Ca2+結(jié)合EF-hand結(jié)構(gòu)域[21]，使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，產(chǎn)生ROS并誘發(fā)多種生理學(xué)效應(yīng)。

Osrboh A是第一個被鑒定的NADPH氧化酶編碼基因，之后大量的rboh基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotiana tabacum L.）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）、西瓜（Citrullus lanatus）、小麥（Triticum aestivum L.）、苜蓿（Medicago sativa）、葡萄（Vitis vinifera）等植物中被報道[22]。rboh基因在不同植物中的表達(dá)存在組織差異性，如Atrboh E、Hvrboh E、Vvrboh E在根中表達(dá)，Atrboh F、Hvrboh F1、Hvrboh F2和Atrboh D、Vvrboh D在所有的組織中均有表達(dá)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)Sirboh D、Sirboh F基因在谷子幼苗的根和葉片中都有表達(dá)。不同濃度的Cd、Cr誘導(dǎo)Sirboh D和Sirboh F基因的表達(dá)存在差異性，Sirboh D和Sirboh F在葉片和根中表達(dá)規(guī)律不同（圖4）。在擬南芥中，基因轉(zhuǎn)錄分析顯示不同的rboh基因?qū)d響應(yīng)表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄變化：rboh F表達(dá)是瞬時增加，而rboh C 和rboh D的轉(zhuǎn)錄水平不變[23]。由此推測Cd、Cr誘導(dǎo)Sirboh D和Sirboh F基因表達(dá)的差異，存在兩方面可能的原因：一方面，Cd、Cr脅迫產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)一步將這一信號傳遞給不同組織中的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)編碼NADPH氧化酶基因的表達(dá)；另一方面，Cd、Cr脅迫激活體內(nèi)其他信號分子來調(diào)控NADPH氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。

本研究中發(fā)現(xiàn)編碼NADPH氧化酶的兩個基因Sirboh D和Sirboh F表達(dá)水平與其活性不完全顯示相關(guān)，分析其可能的原因是Sirboh D和Sirboh F表達(dá)只反應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，而酶活則體現(xiàn)蛋白水平，這是兩種不同的分子機(jī)制，所以Sirboh D和Sirboh F基因的高表達(dá)不一定顯示出NADPH氧化酶活性的增強(qiáng)。Jakubowska等[24]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1Cd處理黃瓜3 d增加CsRbohF1、CsRbohF2、CsRbohF3和CsRbohJ基因的表達(dá)水平，但這并沒有導(dǎo)致NADPH氧化酶活性增加。在植物體內(nèi)NADPH氧化酶和SOD酶參與催化的反應(yīng)可產(chǎn)生H2O2[25]，但在Cd、Cr脅迫下二者響應(yīng)存在差異（圖2和圖3）；POD、APX和CAT三種抗氧化酶被認(rèn)為參與清除體內(nèi)ROS（·、H2O2、1O2及OH·），且在重金屬脅迫下有活性增強(qiáng)的趨勢[6，17]。Cd、Cr顯著誘導(dǎo)POD、APX和CAT的活性升高（表4），從而增強(qiáng)胞內(nèi)對H2O2的清除能力，表明植物體自身能夠緩解H2O2對機(jī)體的氧化損傷[25]。由此推測，植物在重金屬脅迫下，能夠通過NADPH氧化酶這條途徑來調(diào)節(jié)ROS代謝，響應(yīng)重金屬脅迫的損傷。

4　結(jié)論

（1）Cd、Cr抑制谷子幼苗生長，并產(chǎn)生一系列生理指標(biāo)的變化，主要表現(xiàn)為葉綠素含量降低、脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)、產(chǎn)生大量的H2O2造成植株不同程度的損傷。

（2）Cr脅迫上調(diào)Sirboh D和Sirboh F基因表達(dá)，Cd僅增加葉片中Sirboh F表達(dá)量；低濃度脅迫時SOD活性升高，而高濃度時NADPH氧化酶的活性增強(qiáng)，兩者活性的變化在響應(yīng)Cd、Cr脅迫時存在差異，機(jī)體通過增強(qiáng)POD、APX和CAT的活性來應(yīng)對氧化脅迫，在一定程度上對植物體產(chǎn)生保護(hù)作用。

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TIAN Bao-hua, ZHANG Yan-jie, ZHANG Li-ping, et al. Effects of cadmium or chromium on growth and NADPH oxidase and antioxidant enzyme system of foxtail millet seedlings[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（2）：240-246.

Effects of cadmium or chromium on growth and NADPH oxidase and antioxidant enzyme system of foxtail millet seedlings

TIAN Bao-hua, ZHANG Yan-jie, ZHANG Li-ping, MA Xiao-li, JIN Zhu-ping, LIU Zhi-qiang, LIU Dan-mei, PEI Yan-xi*
（School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China）

Abstract：Different heavy metals can induce various stress tolerance mechanisms in plants. Here a solution culture was used to investigate the effects of different concentrations of cadmium（Cd）or chromium（Cr）on growth, hydrogen peroxide（H2O2）, chlorophyll, malondialdehyde（MDA）concentration, NADPH oxidase and antioxidant enzyme activities of foxtail millet seedlings. Results showed that plant height, root length and chlorophyll content were inhibited by Cd or Cr. Content of H2O2and MDA was increased under Cd or Cr stresses. Increasing Cd or Cr concentrations increased NADPH oxidase activity in roots and leaves by inducing the expression of related genes, Sirboh D and Sirboh F, and peroxidase（POD）, catalase（CAT）and ascorbate peroxidase（APX）activities at high concentrations. Superoxide dismutase （SOD）activity increased at low Cd or Cr concentrations, whereas it decreased at high concentrations. These results indicate that heavy metal stresses in foxtail millet alter physiological parameters, and cause various plant damages, but may also increase antioxidant enzyme activities, thus protecting the plant from further damages.

Keywords：cadmium; chromium; NADPH oxidase; foxtail millet

*通信作者：裴雁曦E-mail：peiyanxi@sxu.edu.cn

作者簡介：田保華（1985—），男，山西原平人，博士研究生，從事植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：tbh_3893765@163.com

基金項(xiàng)目：山西省青年科技研究基金（2014021026-2）；山西省青年科技研究基金（2014021026-1）；國家青年基金項(xiàng)目（31501772）

收稿日期：2015-09-11

中圖分類號：X503.231

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0240-07

doi:10.11654/jaes.2016.02.005