楊 悅，許智慧，劉 妍，徐東平

·專題綜述·

HBV動物模型研究進展

楊 悅，許智慧，劉 妍，徐東平

HBV感染動物模型是研究HBV致病機制、篩選新型有效抗HBV藥物和治療方法的重要工具，然而HBV感染具有高度組織特異性以及種屬特異性，這給HBV感染動物模型的建立帶來了困難。近年來，隨著分子生物學、實驗動物學、病毒學及免疫學等相關學科技術的進步，HBV感染或復制動物模型取得了明顯進展。目前應用于HBV（包括與HBV具有相似特性的動物肝炎病毒）研究的動物模型主要包括黑猩猩、樹鼩、土撥鼠及鴨HBV感染模型，HBV轉基因小鼠、高壓水動力注射介導的小鼠HBV復制模型和重組腺相關病毒載體介導的小鼠HBV復制模型，以及人源化人-鼠嵌合肝臟HBV感染模型，此外，鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白轉基因小鼠感染模型是近年的研究熱點。本文就上述HBV動物模型的研究進展進行綜述。

乙型肝炎病毒；乙型肝炎；模型， 動物；感染

HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝病毒科，從1967年首次被發(fā)現(xiàn)以來，到目前為止全世界約20億人感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV攜帶者［1］。HBV作為人類最常見的病原體之一，已經(jīng)嚴重危害人類健康。HBV相關動物模型的建立對進一步探索優(yōu)化慢性HBV感染治療策略具有重要意義。目前應用于HBV研究的模型主要包括細胞模型和動物模型，其中HBV細胞模型并不能很好地再現(xiàn)病毒在體內致病的全過程，因此建立合適的HBV感染實驗動物模型較細胞模型則對篩選有效抗HBV藥物及探索HBV感染機制等更具優(yōu)勢。近年來，隨著HBV病毒學和相關生命科學技術的發(fā)展，HBV感染實驗動物模型研究也獲得了一定進展。本文就目前應用于HBV研究的實驗動物模型綜述如下。

1 靈長類動物感染人HBV模型

黑猩猩可以感染人HBV，且感染過程與人感染HBV十分類似，可發(fā)展為急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎（慢乙肝），并可對HBV產(chǎn)生免疫反應，因此是HBV研究中最為理想的動物模型。在HBV感染和清除機制的研究、HBV疫苗和新藥的研發(fā)以及血清中HBV滅活方法等研究中起到過至關重要的作用［2］。

2004年，Wieland等［3］用黑猩猩急性HBV感染模型研究HBV cccDNA在體內的清除機制，認為其清除過程為細胞免疫應答介導的，首先經(jīng)非細胞毒性作用減少cccDNA的量，然后通過肝細胞凋亡或誘導肝細胞轉化進一步使cccDNA的量減少。2013年，Lanford等［4］研究Toll樣受體（Tolllike receptors， TLR）7激活劑GS-9620對黑猩猩慢性HBV感染模型的免疫激活作用，結果顯示GS-9620可激活TLR7致使免疫細胞清除感染HBV的肝細胞，或可應用于慢性乙型肝炎的治療。

但由于WHO對黑猩猩模型應用的限制，以及黑猩猩動物模型較高的實驗經(jīng)費需求，使其不能作為常規(guī)HBV感染模型推廣應用，近年來學者也在積極尋找可替代黑猩猩的天然感染人HBV的非人哺乳動物模型。Dupinay等［5］通過研究發(fā)現(xiàn)一種毛里求斯島的食蟹猴可天然持續(xù)感染HBV，并證實該病毒很可能來自人HBV。Bukh等［6］發(fā)現(xiàn)獼猴有可能成為替代黑猩猩的非人哺乳動物模型。然而這些模型能否用于HBV感染的研究仍待進一步實驗證實。

2 樹鼩感染人HBV模型

樹鼩是一種外形類似松鼠的小型哺乳動物。2013年我國學者Fan等［7］通過一項研究，結果支持樹鼩是靈長動物的近緣旁系群，并于2014年創(chuàng)建了樹鼩基因組數(shù)據(jù)庫［8］。國內最早對樹鼩是否可以感染人HBV進行了研究［9］，之后國內外學者陸續(xù)有研究證明樹鼩可以感染人HBV，但感染過程中的病毒復制率和抗原表達量均較低［10-11］。2012年，Wang等［12］用HBV陽性血清接種實驗室飼養(yǎng)的新生樹鼩，成功建立了6只慢性HBV感染模型，病毒血癥可持續(xù)48周。以上研究顯示樹鼩是除靈長類動物外可天然感染人HBV的理想動物。

基于樹鼩可慢性感染HBV的事實，2015年Yang等［13］報告了對6只慢性感染HBV的新生樹鼩長達（245.7±90.9）周的觀察結果，發(fā)現(xiàn)其中2只在疾病后期發(fā)展成為肝細胞癌，為慢乙肝是肝細胞癌的重要危險因素提供了動物實驗依據(jù)。

樹鼩具有體型小、繁育能力強、管理方便、廉價易得且擁有長約8年壽命等優(yōu)點。但樹鼩遺傳穩(wěn)定性不足，個體差異大，且HBV感染樹鼩模型的成功率在不同研究團隊所得結果差異較大，存在爭議，對于該模型還須深入探索。

3 嗜肝DNA病毒動物模型

嗜肝DNA病毒科包括正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬共2個屬，前者包括人HBV、土撥鼠肝炎病毒（woodchuck hepatits virus， WHV）、樹松鼠肝炎病毒和地松鼠肝炎病毒等；后者包括鴨HBV（duck HBV， DHBV）和蒼鷺HBV等。這些病毒與人HBV具有相似的復制周期和感染相應宿主的特性，故可作為研究人HBV的替代病毒。常用的為土撥鼠肝炎模型和鴨乙型肝炎模型。

3.1 土撥鼠肝炎模型 1978年Summers等［14］發(fā)現(xiàn)Penrose實驗室飼養(yǎng)的北美土撥鼠群血清標本約15%含有HBV樣病毒顆粒，稱之為WHV，土撥鼠是其天然宿主。Wang等［15］對中國的土撥鼠喜馬拉雅亞種、阿爾泰亞種和內蒙亞種對WHV的易感性進行了比較，結果顯示土撥鼠喜馬拉雅亞種對WHV最為易感。王亮等［16］通過對1月齡的土撥鼠頸外靜脈注射感染了2組不同劑量（高劑量：2.5×107WID50；低劑量：5×106WID50）的WHV，研究發(fā)現(xiàn)低劑量組土撥鼠肝炎呈急性自限性，而高劑量組土撥鼠肝炎呈現(xiàn)出急性感染轉為慢性感染，提示急性肝炎的病程發(fā)展除與土撥鼠感染年齡相關外，也與感染病毒的劑量有關。

最近，Wang等［17］應用中國土撥鼠肝炎模型研究基于核苷（酸）類似物的藥物治療策略對于人HBV暴露后預防的效果研究，結果證明應用該策略可完全抑制中國土撥鼠肝炎模型體內的病毒復制，但若類推到人HBV暴露后預防仍須進一步實驗證實。Fletcher等［18］研究用重組土撥鼠干擾素（woodchuck interferon， wIFN）治療慢性土撥鼠肝炎模型時的分子機制，通過對其治療過程中的血清學指標、轉錄譜和肝臟病理變化進行動態(tài)監(jiān)測和比對，發(fā)現(xiàn)相較于wIFN-α誘導肝內產(chǎn)生的INF-α刺激基因產(chǎn)生的直接抗病毒作用，wIFN-α對慢性土撥鼠肝炎的治療作用與NK/T細胞溶解和非細胞溶解機制介導的免疫反應關系更為密切。這為探尋慢性HBV感染的合理治療策略提供了新的參考。

土撥鼠肝炎模型是研究慢乙肝感染機制、免疫病理學和免疫治療的有效模型，但由于遺傳背景差異，從該模型得到的結論并不能完全真實的反應HBV在人體內的狀態(tài)。此外，WHV品系不夠純化、研究免疫反應的抗體配套不全以及動物價格昂貴仍是制約該模型廣泛應用的瓶頸。

3.2 鴨乙型肝炎模型 鴨乙型肝炎模型是禽嗜肝DNA病毒屬中最為成熟的肝炎動物模型。1980年，Mason等［19］在北京鴨血清中發(fā)現(xiàn)1種直徑40 nm，電鏡結構和復制周期與人HBV相似的DNA病毒，該病毒定植于鴨肝臟中復制，命名為DHBV。隨后，世界各地學者均有不同鴨群DHBV感染的報道。其中，我國學者蘇何玲等［20］克隆了桂林麻鴨DHBV基因組并對其特點進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)其序列全長3027 bp，除具有S、P、C開放閱讀框架外，還具有一編碼未知多肽的開放閱讀框架，通過分析顯示該多肽具有與HLA*0201結合的模體結構；比對不同國家和地區(qū)的DHBV序列，并未發(fā)現(xiàn)明顯的地域分布特點，為應用桂林麻鴨作為乙型肝炎動物模型提供了實驗依據(jù)。

2002年，Kundgen等［21］將DHBV感染模型用于病毒復制抗性基因的研究，證明在DHBV感染前轉導顯性負性突變體（抗性基因的一種）可有效抑制病毒復制，為HBV感染基因治療提供了體內實驗依據(jù)。最近，Noordeen等［22］用DHBV靜脈注射感染出生14 d的綠頭鴨，構建出DHBV持續(xù)感染鴨模型，用以研究核苷酸類似物REP 2055對持續(xù)性DHBV感染的抗病毒效果，結果表明REP 2055可持久性抑制持續(xù)性DHBV感染，這可能與REP 2055能阻斷受感染的肝細胞釋放DHBsAg的獨特作用有關。

DHBV感染模型分布廣泛、價格經(jīng)濟、易飼養(yǎng)且實驗中易于操作，曾被廣泛應用于HBV基因突變、細胞表面病毒受體、病毒清除機制以及篩選新的抗病毒藥物的研究。但DHBV與人HBV同源性差，不同鴨種的DHBV感染模型也為對比不同報告造成了影響，因此該模型的研究結論仍不能充分體現(xiàn)人HBV感染的全過程。

4 小鼠HBV復制和感染模型

小鼠因其價格便宜、易于獲取及體型小易于飼養(yǎng)等優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)學研究的各個領域。盡管由于人HBV具有宿主特異性，小鼠不能天然感染人HBV，但通過諸如轉基因、高壓水動力注射、重組腺相關病毒介導及人源化人-鼠嵌合肝臟等方法介導，可實現(xiàn)人HBV在小鼠體內復制甚至人工感染以應用于人HBV相關研究。

4.1 HBV轉基因小鼠 轉基因技術可以實現(xiàn)完整的HBV基因組或單個基因在小鼠肝臟細胞的表達。1985年Chisari等［23］率先應用受精卵顯微注射法構建了攜帶HBV全基因、部分HBV DNA片斷或超長HBV DNA片斷的轉基因小鼠模型，但HBV復制水平和抗原表達量均偏低。隨后Guidotti等［24］從多種HBV重組復制質粒中篩選出高表達的 1.3倍HBV基因組全長質粒并建立了高水平復制的HBV轉基因小鼠，HBsAg表達量可達700 ng/ml，為HBV抗感染治療提供了較好的模型基礎。但這種轉基因小鼠模型存在2個問題：其一，對HBV抗原天然免疫耐受，不能用于免疫學相關評價；其二，缺少病毒感染環(huán)節(jié)，檢測不到HBV轉錄、復制中間體cccDNA，不能用于HBV體內感染機制的研究。

針對第一個問題，Larkin等［25］用HBV轉基因小鼠與重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency disease， SCID）小鼠雜交，建立了HBV持續(xù)復制和表達的HBV/SCID轉基因小鼠模型，之后對其過繼相同遺傳背景含T、B淋巴細胞的小鼠脾臟細胞以建立正常免疫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)了急性肝損傷并在后期進展為慢性肝炎。針對第二個問題，自我國學者李文輝課題組首先發(fā)現(xiàn)鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白（Na+-dependent sodium taurocholate cotransporter protein， NTCP）為肝細胞感染HBV的功能性受體以來，國內外已有多個課題組對NTCP轉基因小鼠感染HBV進行了研究，結果表明，雖然NTCP轉基因小鼠可以感染具有HBV外膜蛋白的HDV［26］，但受小鼠肝細胞內缺乏與HBV作用的某些蛋白和存在某些限制因子影響而難以獲得有效感染［27-28］。相關研究仍在進行當中。

最近，Yu等［29］用攜帶1.3倍HBV基因組全長質粒（ayw亞型）轉基因小鼠模型研究1種新的質粒編碼小鼠DEC-205單鏈DNA疫苗（mDEC-205-scFv-fused DNA）的有效性，結果顯示小鼠血清HBsAg水平與HBV DNA拷貝數(shù)的表達下 調。Wang等［30］用C57BL/6 WT和C57BL/6JTg（A1b1HBV）44Bri/JHBV轉基因小鼠模型驗證粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor， GM-CSF）可作為HBV疫苗治療的佐劑，結果表明，利用GM-CSF作為佐劑聯(lián)合重組HBV疫苗有望成為免疫治療慢乙肝的新方案。Li等［31］用C57BL/6J-Tg（Alb1HBV）44Bri/JHBV（包含HBV基因組前S區(qū)、S區(qū)和X區(qū)）轉基因小鼠模型，研究轉化生長因子（transforming growth factor， TGF）-β1對肝星狀細胞（HSC）的激活機制，結果顯示TGF-β1-CD147回路在調節(jié)HSC活性過程中起著關鍵作用，聯(lián)合使用TGF-β受體抑制劑和抗CD147抗體有可能逆轉肝纖維化。

HBV轉基因小鼠模型已廣泛應用于HBV慢性感染的研究，對于免疫耐受和感染環(huán)節(jié)問題的解決，將大大提升其應用價值。目前，NTCP轉基因小鼠模型是HBV感染模型的研究熱點之一，若能通過基因工程技術在小鼠肝細胞中表達某些促進HBV復制的分子，有可能使NTCP有效介導小鼠自然感染HBV，使其成為經(jīng)濟實用的HBV感染小動物模型。

4.2 高壓水動力注射介導的小鼠HBV復制模型 高壓水動力注射是將大量DNA質粒在短時間內快速經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內，由于注射量接近小鼠循環(huán)血容量，可導致小鼠血壓迅速升高，使大量含有質粒的血液聚集于小鼠下腔靜脈并通過肝門靜脈逆流進入肝臟與肝細胞接觸，避免了DNA質粒經(jīng)血液循環(huán)被DNA酶降解，使轉染效率大大提高［32-33］。Yang等［34］應用此法，將1.3倍HBV基因組全長的質粒導入B10.D2小鼠體內，成功構建了急性小鼠HBV復制模型，但其病毒復制僅持續(xù)15 d便檢測不到。為了解決小鼠體內HBV復制時間短的問題，2006年Huang等［35］用腺相關病毒（adeno-associated virus， AAV）真核表達載體替換傳統(tǒng)基因載體結合高壓水動力法，以延長HBV在小鼠體內復制時間，將1.2倍HBV基因組全長連接到AAV載體直接導入C57BL/6小鼠肝細胞內，建立了小鼠HBV持續(xù)感染模型，模型成功率達到40%。然而，郭燕菊等［36］采用相同策略，發(fā)現(xiàn)正常免疫狀態(tài)下僅檢測到HBsAg和HBeAg持續(xù)10 d的一過性表達，未能獲得 HBV 持續(xù)復制模型；而經(jīng)過地塞米松處理（處于免疫抑制狀態(tài)下），小鼠體內病毒復制時間延長。蔡啟茵等［37］應用高壓水動力法將人HBV血清注入Babl/c乳鼠體內，因乳鼠免疫力低下，未能有效清除進入體內的HBV病毒，成功使其感染 HBV，證實了乳鼠免疫力低且對HBV存在易感性，為建立HBV感染小鼠模型提供了依據(jù)。

高壓水動力法介導的小鼠HBV復制模型廉價易制備，且該模型小鼠具有免疫功能，可用于宿主免疫系統(tǒng)對感染肝細胞清除的研究；缺點是雖具有相對較高的轉染效率，但與重組AAV介導的小鼠HBV復制模型相比，其基因轉染效率相對較低，表達時間亦較短，不適用于慢性HBV感染的實驗研究。

4.3 重組AAV8載體介導的小鼠HBV復制模型 AAV屬微小病毒科，具有位點特異性的整合能力、自然缺陷及免疫原性低等特點，并且AAV有多種血清型，不同血清型具有器官特異性，使其成為理想的基因靶向載體，現(xiàn)已廣泛應用于基因治療和基礎研究。2009年，Pa?eda等［38］研究發(fā)現(xiàn)對于肝臟的轉導效率AAV8優(yōu)于AAV1、5和6血清型。基于這一特點，我國董小巖等［39］應用高嗜肝性的重組AAV8載體攜帶1.3倍HBV基因組全長（rAAV8-1.3HBV，ayw亞型）體內轉導法，成功建立了HBV在肝內穩(wěn)定復制且能夠持續(xù)表達HBV抗原的小鼠模型；隨后王國婧等［40］探索用該模型評價核苷酸類似物抗病毒藥物的抗病毒效果，結果表明rAAV8-1.3HBV介導的小鼠HBV復制模型制備簡單，成模率高，可有效體現(xiàn)出ETV和LAM的抗HBV效果，因此可用于核苷（酸）類似物抗HBV藥作用效果的篩查。以上研究雖均有HBV在小鼠體內持續(xù)表達，卻無肝臟病理改變的發(fā)現(xiàn)。最近，Ye等［41］用AAV8/HBV1.2體內轉導法，建立了小鼠HBV持續(xù)復制和轉錄模型，病毒血癥可持續(xù)6個月，雖未發(fā)現(xiàn)急性肝損傷卻發(fā)現(xiàn)了肝纖維化的病理改變，提示該模型可用于慢乙肝進程中肝纖維化發(fā)生機制的研究。

重組AAV8載體介導的小鼠HBV復制模型較高壓水動力介導的小鼠HBV復制模型成模率更高，且病毒在小鼠體內復制和抗原表達的時間更長。但價格昂貴，且與重組AAV8載體介導的小鼠HBV復制模型同樣缺少HBV進入宿主的自然感染環(huán)節(jié)，目前是否可以用于HBV免疫學研究還存在爭議，一定程度上限制了該模型的應用。

4.4 人源化人-鼠嵌合肝臟HBV感染模型 移植有功能的人肝組織細胞的免疫缺陷小鼠被稱為人源化人-鼠嵌合肝臟小鼠。Mercer等［42］成功構建了第一例人源化人-鼠嵌合肝臟模型，即uPASCID小鼠。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）基因的轉入導致肝細胞自發(fā)死亡，從而為人源肝臟的構建提供了可能。用uPA-SCID模型可以獲得重建率較高的人源化肝臟模型，并且可以感染HBV。但該模型小鼠免疫系統(tǒng)受損，感染人HBV后不能出現(xiàn)相應的免疫病理損傷。

為解決這一問題，Washburn等［43］嘗試構建出肝臟與免疫系統(tǒng)雙人源化的小鼠模型，通過AFC8-hu HSC/Hep系統(tǒng)，利用人的造血干細胞和肝臟祖細胞同時構建人源化的免疫系統(tǒng)和肝臟，并在此基礎上成功感染了HCV。美國北卡大學Bility等［44］將此模型進行了改進，目前已成功建立了肝臟與免疫系統(tǒng)雙人源化的HBV小鼠感染模型，即A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠模型，該模型不但HBV感染率接近75%，感染持續(xù)4個月以上，而且可對HBV產(chǎn)生免疫應答并出現(xiàn)病理損傷。該研究為HBV相關免疫機制的研究提供了非常有價值的模型基礎。

人源化人-鼠嵌合肝臟HBV感染模型可以模擬人HBV自然感染過程，并且可以產(chǎn)生HBV復制中間體cccDNA，具有人類免疫系統(tǒng)使其成為HBV感染相關機制和HBV疫苗研發(fā)的模型基礎。但該模型制備過程復雜、周期長且產(chǎn)量低，這些問題還有待解決。

5 展 望

理想中的HBV動物模型應該是與人類親緣關系相近， 并對人HBV感染率高、感染的維持時間長且感染后能發(fā)生相應病理改變的經(jīng)濟實用、易于標準化的動物模型，且最好同時具有正常免疫系統(tǒng)以便于評價免疫反應。雖然HBV實驗動物模型的研究與應用已取得了很大進展，也為HBV相關研究做出了突出貢獻，但到目前為止尚無一種HBV動物模型同時滿足上述所有條件。又由于人肝組織樣本來源十分有限，難以滿足相關實驗研究，所以HBV動物模型仍是探索和認識慢乙肝發(fā)生發(fā)展機制和治療方法的惟一有效手段。目前研究者可以根據(jù)具體研究內容在上述模型中選擇相對合適的HBV感染或復制動物模型進行實驗研究。

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（2015-12-16 收稿 2016-02-22 修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 盧福昱）

Advances in animal models of HBV infection and replication

YANG Yue， XU Zhi-hui， LIU Yan*， XU Dong-ping*Research Center for Clinical and Translational Medicine， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China *Corresponding author. LIU Yan， liuyan5360@163.com； XU Dong-ping， E-mail: xudongping302@sina.com *Corresponding author. LIU Yan， E-mail: liuyan5360@163.com； XU Dong-ping， E-mail:xudongping302@sina.com

HBV infection animal model is an essential tool for studying pathogenesis of HBV and screening novel and effective anti-HBV drugs or treatment methods. However， HBV infection is highly tissue specific and species-specific， which brings difficulties to the establishment of HBV infection model. In recent years， with advances in technology of related disciplines such as molecular biology， experimental zoology， virology， and immunology， obvious progress has been acquired in HBV infection or replication animal models. Currently-used HBV animal models （including those models for animal hepatitis with similar characteristics of HBV） are mainly comprised of chimpanzee， tree shrew， woodchuck， and duck viral infection model， HBV transgenic mouse， hydrodynamic injection of HBV vector， and adeno-associated virus-mediated mouse HBV replication models， as well as human-murine liver chimeric mouse HBV infection model. In addition， sodium-taurocholate co-transporter transgenic mouse model is a hotspot in recent years. This article provides an overview of advances in above-mentioned HBV animal models.

hepatitis B virus； hepatitis B； models， animals； infection

［中國圖書資料分類號］ R-332；R373.21 A

1007-8134（2016）04-0236-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.04.010

國家自然科學基金面上項目（81371852，81573676）［作者單位］ 541004 廣西，桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院（楊悅）；100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心（楊悅、許智慧、劉妍、徐東平）

徐東平，E-mail: xudongping302@sina.com；劉妍，liuyan5360@163.com