陳一平，姜曉紅，封廣義，孫起翔，羅明潔，李超乾

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科、2.老年呼吸內(nèi)科，廣西 南寧　530021)

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不同品系小鼠肥胖哮喘模型建立及比較

陳一平1，姜曉紅2，封廣義1，孫起翔1，羅明潔1，李超乾1

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科、2.老年呼吸內(nèi)科，廣西 南寧530021)

中國圖書分類號：R-332；R363-332；R562.25；R589.2

摘要:目的建立并比較不同品系小鼠營養(yǎng)性肥胖哮喘模型。方法選用KM、C57BL/6J、BALB/c 3個品系♀小鼠，隨機分為對照組、哮喘組、肥胖組、肥胖哮喘組，分別以高脂飼料或普通飼料飼喂12周后，以卵清蛋白(OVA)或磷酸鹽緩沖液(PBS)致敏激發(fā)小鼠，實驗終點測定小鼠體重、身長、脂肪重量、肝臟重量、Lee′s指數(shù)、血清總膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中OVA特異性IgE濃度。觀察各組脂肪細胞形態(tài)及氣道病理學(xué)改變。測定各組小鼠的特殊氣道阻力(sRaw)。結(jié)果KM肥胖組體重及Lee′s指數(shù)增長最快，但哮喘特征性表現(xiàn)不明顯；C57BL/6J小鼠能形成哮喘特征性表現(xiàn)，但肥胖相關(guān)指標(biāo)差異無顯著性；BALB/c肥胖組小鼠肥胖指標(biāo)較之正常組差異有顯著性。經(jīng)OVA致敏激發(fā)后，BALB/c小鼠顯示出更加明顯的哮喘癥狀、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥表現(xiàn)。結(jié)論BALB/c小鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)，OVA致敏激發(fā)能形成良好的肥胖合并哮喘模型。

關(guān)鍵詞：肥胖;哮喘;動物模型；KM小鼠；C57BL/6J小鼠；BALB/c小鼠

流行病學(xué)資料顯示，肥胖會增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險，在成人是2~3倍[1]，兒童是1~2倍[2]。且合并肥胖的哮喘具有進展迅速、藥物效果差、皮質(zhì)類固醇激素類藥物不敏感等特點，影響病人的治療效果及預(yù)后。為研究肥胖合并哮喘的發(fā)病機制及治療策略，合適的動物模型就顯得尤為重要。目前，國內(nèi)外研究肥胖哮喘模型制作缺乏系統(tǒng)完善的評價，呼吸功能測定往往需要麻醉小鼠后行氣管插管，與人類哮喘發(fā)作時的狀態(tài)相差甚遠。營養(yǎng)性肥胖合并哮喘造模周期都相對較長，哪種實驗動物更能提高造模的成功率，更接近人類肥胖哮喘的疾病特點，目前鮮見報道。本實驗通過建立3種常用品系的小鼠營養(yǎng)性肥胖哮喘模型，比較肥胖及哮喘相關(guān)指標(biāo)的差異，為營養(yǎng)性肥胖合并哮喘小鼠模型的制作提供參考。

1材料

1.1動物所有小鼠均為SPF級3~4周齡斷乳♀小鼠。 C57BL/6J小鼠體質(zhì)量12~14 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2008-0002。KM小鼠體質(zhì)量16~20 g，BALB/c小鼠體質(zhì)量12~14 g，均購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2003-0003。

1.2試劑血清甘油三酯、總膽固醇測定試劑盒：北京利德曼生化股份有限公司。小鼠OVA特異性IgE測定ELISA試劑盒：美國Biolegend公司。OVA(雞卵清蛋白，Grade V)：美國Sigma公司。氫氧化鋁凝膠(濃度40 g·L-1)：美國Pierce公司。

1.3儀器酶標(biāo)儀(MK3型)：美國Thermo公司。全密閉真空組織脫水機(HD-300)、石蠟包埋機(YB-6LF)：湖北惠達儀器有限公司。石蠟切片機(Eeisshm340e)：德國蔡司公司。正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(CX41-32)：日本奧林巴斯公司。顯微圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus。無創(chuàng)動物肺功能儀(TBL4500型)： 美國BUXCO公司。

2方法

2.1動物分組及模型制備KM、C57BL/6J、BALB/c小鼠經(jīng)3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分為對照組、哮喘組、肥胖組和肥胖哮喘組，每組8只。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境(設(shè)施許可證 SCXK桂2003-0003)，保持溫度(23±3)℃,濕度(55.5±10)%,給予顆粒飼料，自由飲水。對照組及哮喘組給予常規(guī)飼料(脂肪供能比0.123)；肥胖組和肥胖哮喘組給予高脂飼料(脂肪供能比0.430)，每周測量身長及體重變化。飼養(yǎng)12周后，哮喘組和肥胖哮喘組每只小鼠分別于d 0、7、14給予OVA混懸液(OVA 25 μg、氫氧化鋁凝膠4 mg溶于20 μL PBS液中)腹腔注射，d 21起給予質(zhì)量濃度為10 g·L-1OVA 30 mL霧化吸入，隔日1次，每次30 min，連續(xù)5次。于飼養(yǎng)16周，各組小鼠禁食12 h行肺功能檢測，摘眼球取血，離心分離血清，測定甘油三酯、總膽固醇。取支氣管肺泡灌洗液進行OVA特異性IgE水平測定。解剖取左肺上葉進行HE染色，進行肺組織細胞病理形態(tài)學(xué)觀察。

2.2Lee′s指數(shù)實驗終點測量小鼠體重、體長(小鼠鼻尖到肛門外沿的距離)。計算Lee′s指數(shù)[3]=[體重(g)1/3/體長(cm)× 1 000]。

2.3脂肪重量精確分離腹腔內(nèi)(包括腸系膜、大網(wǎng)膜、雙側(cè)腎周及生殖器周圍)脂肪組織，稱濕重后，進行脂肪細胞形態(tài)學(xué)觀察和計量。

2.4脂肪細胞形態(tài)觀察計量脂肪組織進行石蠟包埋，HE染色，參照Ketonen等[4]的研究方法對脂肪細胞進行形態(tài)計量：每只動物40倍物鏡隨機5張顯微照片，使用Image-Pro Plus7.0顯微分析系統(tǒng)測量脂肪細胞橫截面面積。

2.5支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IgE水平測定酶聯(lián)免疫吸附法測定哮喘模型小鼠BALF中IgE的表達量。

2.6小鼠sRaw增長率BUXCO TBL4500型無創(chuàng)動物呼吸機(美國)測定小鼠特殊氣道阻力(specific airway resistance,sRaw, cm H2O×sec)。sRaw增長率=(吸入不同濃度乙酰甲膽堿后sRaw測定值-吸入PBS后sRaw測定值)/吸入PBS后sRaw測定值。

3結(jié)果

3.1肥胖評價指標(biāo)

3.1.1體重增長曲線3個品系的小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后，體重表現(xiàn)出與正常喂養(yǎng)組相比更加迅速的增長趨勢，其中KM小鼠體重增長更加明顯，且差異達到顯著性的周期是3個品系中最短的。在實驗終點，BALB/c肥胖小鼠及C57BL/6J肥胖小鼠體重較之正常組差異亦有顯著性，但前者更加明顯(Fig 1)。

3.1.2體重、脂肪重量、肝臟重量、Lee′s指數(shù)實驗終點，3個品系小鼠體質(zhì)量、脂肪重量、肝臟重量、Lee′s指數(shù)與對照組比較均升高。與單純哮喘組相比，肥胖哮喘組KM小鼠及BALB/c小鼠體質(zhì)量、脂肪重量、肝臟重量、Lee′s指數(shù)等肥胖指標(biāo)差異均有顯著性(P<0.01)，C57BL/6J小鼠肥胖哮喘組與單純哮喘組比較，體質(zhì)量、Lee′s指數(shù)差異有顯著性(P<0.05)，脂肪重量及肝臟重量差異無顯著性(Tab 1)。

3.1.3脂肪細胞形態(tài)學(xué)觀察及計量與劉芳等[5]研究結(jié)果有所出入，實驗終點KM高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪細胞橫截面積與正常飼料喂養(yǎng)組比增加明顯(P<0.01)，BALB/c小鼠脂肪細胞變化不及KM小鼠明顯，但差異有顯著性(P<0.05)，C57BL/6J小鼠脂肪細胞面積較對照組無明顯差異(Fig 2、3)。

Fig 1　Growth of body weight

Fig 2　Photomicrographs of adipose tissue in mice(HE×400)

GroupBodyweight/gFatwwt/gLiverweight/gLee'sindexKMControl34.83±1.600.95±0.321.50±0.3215.73±0.46Obesity39.83±2.05**2.16±0.65**1.99±0.21**16.25±0.27*Asthma33.65±1.430.71±0.291.26±0.2315.10±0.24Obeseasthma39.76±2.80##2.90±0.83##1.98±0.12##15.83±0.48##BALB/cControl25.65±1.010.33±0.200.92±0.0814.64±0.23Obesity30.35±2.54**0.72±0.09**1.25±0.19*15.35±0.39**Asthma24.28±0.540.33±0.200.87±0.0614.53±0.17Obeseasthma29.94±1.87##0.71±0.20##1.09±0.06##15.25±0.49##C57BL/6JControl20.05±1.340.21±0.090.93±0.0613.48±0.32Obesity23.13±1.27*0.40±0.08*1.19±0.07**14.20±0.32**Asthma20.85±0.770.38±0.130.85±0.0913.66±0.12Obeseasthma22.92±0.90#0.48±0.210.90±0.1213.92±0.17#

**P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsasthma

Fig 3　Changes of adipocyte cross-sectional area in ±s,n=8)

**P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsasthma

3.1.4血脂水平變化經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，KM小鼠及BALB/c小鼠血清總膽固醇(TC)水平較普通飼料喂養(yǎng)的小鼠均表現(xiàn)出明顯的增高，說明已出現(xiàn)高膽固醇血癥脂代謝紊亂。C57BL/6J小鼠增高，但差異無顯著性，說明未出現(xiàn)高膽固醇血癥脂代謝紊亂。與劉芳等[5]研究結(jié)果相似，3個品系高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠較之正常喂養(yǎng)的小鼠甘油三酯并未表現(xiàn)出明顯的增高(Tab 2)。

Tab 2　Changes of serum total cholesterol (TC),

**P<0.05，**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsasthma

3.2哮喘評價指標(biāo)

3.2.1哮喘急性發(fā)作癥狀BALB/c及C57BL/6J哮喘小鼠在霧化激發(fā)過程中，不同程度出現(xiàn)頭、鼻、面部搔抓動作，進而呼吸加深加快，躁動不安，后期表現(xiàn)先為少動、弓背、前肢縮抬、點頭呼吸及呼吸急促表現(xiàn)，部分BALB/c小鼠出現(xiàn)呼吸減慢、行為遲滯或俯伏不動，反應(yīng)遲鈍，KM小鼠僅表現(xiàn)為少動及前肢縮抬，且在后面幾次霧化激發(fā)過程中，上述癥狀逐漸減輕。正常對照及單純肥胖組小鼠活動自如，無上述表現(xiàn)。

3.2.2肺組織病理損害如Fig 4所示，3個品系正常組及肥胖組小鼠細支氣管和肺泡清晰，無炎癥細胞浸潤；BALB/c品系哮喘組及肥胖哮喘組小鼠出現(xiàn)細支氣管周圍炎癥細胞浸潤，黏膜皺襞減少等氣道炎癥及氣道重塑表現(xiàn)，較之哮喘組，肥胖哮喘組炎癥改變更甚，炎癥細胞浸潤更明顯，黏膜及平滑肌有斷裂，肺泡不同程度融合表現(xiàn)，肥胖哮喘組小鼠表現(xiàn)更為明顯，并出現(xiàn)平滑肌及基底膜增厚等氣道重塑表現(xiàn)。C57BL/6J小鼠改變相對輕微，KM品系哮喘小鼠氣道炎癥細胞數(shù)量非常少，未見明顯氣道重塑表現(xiàn)。

3.2.3特殊氣道阻力(sRaw)增長率變化sRaw是反映哮喘模型氣道高反應(yīng)性的敏感指標(biāo)。不同乙酰甲膽堿濃度霧化后，sRaw增長率能較好地反映氣道阻力的變化。3個品系經(jīng)OVA致敏和激發(fā)后的哮喘小鼠均表現(xiàn)出sRaw增長率逐步增高的趨勢，以BALB/C哮喘及肥胖哮喘組增高最為明顯(Fig 5)。

3.2.4BALF中OVA-IgE水平變化與Bunyan等[6]研究結(jié)果類似，BALB/c及C57BL/6J肥胖小鼠BALF中OVA特異性IgE的濃度較正常對照組明顯升高，但正常哮喘組較肥胖哮喘組更低，而KM小鼠模型并未表現(xiàn)出該種規(guī)律(Tab 3)。

4討論

一個成功的肥胖哮喘模型必須同時存在營養(yǎng)性肥胖及支氣管哮喘的典型癥狀及相關(guān)實驗室指標(biāo)。高脂飼料所誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖與人類肥胖最為接近，國外研究中常用C57BL/6J小鼠，國內(nèi)研究除C57BL/6J小鼠外，還大量應(yīng)用KM小鼠，主要是因其有適應(yīng)性強，生長迅速的特點。眾所周知，體重、腹腔脂肪重量、Lee′s指數(shù)、脂肪細胞體積改變是判斷肥胖的主要標(biāo)準(zhǔn)。成年動物的肥胖在組織水平表現(xiàn)為脂肪細胞體積的增大。本實驗中3個品系小鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，均表現(xiàn)出體重及脂肪重量的明顯增加，鏡下脂肪細胞橫截面積的明顯增大也反映出脂肪細胞體積的增大。其中KM小鼠體重增加最快，達到體重平臺期周期最短，實驗終點體重、脂肪重量、Lee′s指數(shù)、總膽固醇水平差異均具有顯著性(P<0.01)。C57BL/6J及BALB/c小鼠體重增加相對較緩慢，實驗終點時，BALB/c小鼠的相關(guān)指數(shù)差異具有顯著性(P<0.01)，C57BL/6J的相關(guān)指數(shù)也具有差異，但較之前兩個品系稍差(P<0.05)。且在喂養(yǎng)過程中，C57BL/6J出現(xiàn)部分小鼠脫毛及毛色變紅表現(xiàn)，而其他兩組小鼠均未發(fā)生，考慮為高脂飼料喂養(yǎng)所致維生素缺乏所致，雖經(jīng)飲水中加入復(fù)合維生素后癥狀有所改善，但也反映出C57BL/6J小鼠對高脂飼料的耐受性較其他兩個品系差，一定程度上影響模型的成功率。

Fig 4　Photomicrographs of lung tissue in mice(HE×200)

Fig 5　Rate of sRaw rise

GroupIgE/μg·L-1KMControl1.059±0.311Obesity1.275±0.264Asthma1.281±0.274Obeseasthma1.486±0.244BALB/cControl1.462±0.447Obesity36.286±9.087**Asthma2.320±0.650Obeseasthma27.057±4.905##C57BL/6JControl1.062±0.185Obesity2.743±0.477**Asthma1.329±0.408Obeseasthma1.846±0.788#

***P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsasthma

在哮喘模型的建立中，近年來近交系的BALB/c小鼠因其免疫遺傳背景清楚，品系純，來源廣，相關(guān)生物學(xué)試劑及抗體易獲得而成為主要的哮喘模型動物。而一個良好的哮喘模型，應(yīng)具備氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥及氣道重塑等特點。除常規(guī)判斷哮喘模型的癥狀、BALF灌洗液IgE水平、肺臟病理學(xué)改變外，本研究應(yīng)用了雙室體積描記法測定小鼠sRaw，來反映小鼠氣道反應(yīng)性變化。體積描記法是一種無創(chuàng)的測定氣道阻力和氣道反應(yīng)性的方法，較之有創(chuàng)測定方法，體積描記法具有操作簡單，可反復(fù)操作，數(shù)據(jù)更加接近小鼠生理狀態(tài)的特點。國外早在1979年，Pennock等[7]就將該方法應(yīng)用于豚鼠氣道反應(yīng)性的測定，但受到設(shè)備條件的限制，國內(nèi)到2009年姚衛(wèi)民等[8]才開始應(yīng)用該項技術(shù)測定豚鼠氣道反應(yīng)性。本研究首先將該項技術(shù)應(yīng)用于小鼠的氣道反應(yīng)性的測定及評估，本實驗室購進美國BUXCO公司的最新款雙室體描儀，改進了動物固定裝置，把固定器設(shè)置在動物頸部，使其有一定的活動度，不至于造成動物氣管的擠壓，根據(jù)小鼠體型特點，將封閉并分隔頭室(用于測量鼻部氣流的變化)和體室(用于測量胸腔氣流的變化)的橡膠墊圈緊密包裹小鼠口鼻，更加合理并精確地測定鼻腔比胸腔的氣流滯后時間，從而計算特殊氣道阻力sRaw， 取得了良好的實驗效果。3個品系的小鼠哮喘模型均不同程度表現(xiàn)出氣道阻力較非哮喘組增加，其中以BALB/c小鼠增加更為明顯，且數(shù)據(jù)穩(wěn)定，符合哮喘發(fā)作的臨床特點。KM小鼠經(jīng)OVA致敏及霧化激發(fā)后，癥狀及肺部病理表現(xiàn)出氣道炎癥及氣道反應(yīng)性變化相對不明顯，且因KM小鼠個體增長過快、體型較大，在應(yīng)用雙室體描儀檢測特殊氣道阻力時出現(xiàn)不易安裝的現(xiàn)象。C57BL/6J小鼠性格比較兇猛，在腹腔注射致敏及測氣道阻力時多次咬傷實驗員。

本實驗表明，BALB/c小鼠經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)12周后，能成功造成營養(yǎng)性肥胖模型，在經(jīng)OVA腹腔注射致敏及OVA霧化激發(fā)后能造成典型肥胖合并支氣管哮喘模型，能為肥胖合并哮喘機制及治療研究提供良好的動物模型。

(致謝：感謝廣西醫(yī)科大學(xué)急診醫(yī)學(xué)實驗室全體老師及同學(xué)對本研究的大力支持及協(xié)助！)

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Establishment and comparison of obese asthma models in different strains of mice

CHEN Yi-ping1,JIANG Xiao-hong2,FENG Guang-yi1,SUN Qi-xiang1,LUO Ming-jie1,LI Chao-qian1

(1.DeptofRespiratoryMedicine， 2.DeptofGeriatricRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Abstract：AimTo establish and compare asthma models among different strains of obese mice.MethodsDifferent strains of SPF female mice, namely Kunming (KM) , C57BL/6J and BALB/c mice, were randomly divided into four groups (control group, asthma group, obesity group and obese asthma group). The mice were fed a high-fat diet or a normal diet for 12 weeks, following which they were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) or phosphate-buffered saline (PBS). Body weight, fat weight, liver weight, Lee′s index, OVA-specific IgE concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), serum total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) levels, and lung and adipose morphologies were evaluated. The specific airway resistance (sRaw) was measured using double-chamber plethysmography.ResultsThe mice on a high-fat diet showed a more rapid increase in body weight compared with those on a normal diet. After 12 weeks of feeding, body, fat, and liver weights and Lee′s index were higher for the obese mice than for the lean mice. The adipocyte cross-sectional area was significantly greater in the obese BALB/c and KM mice than in their lean counterparts; the C57BL/6J groups showed no significant differences. The BALB/c mice demonstrated more significant symptoms of acute asthma, local inflammation and airway hyper-responsiveness (AHR).ConclusionCompared with C57BL/6J and KM mice, BALB/c mice fed a high-fat diet and sensitized and challenged with OVA provide the most suitable model for evaluating the relationship between obesity and asthma.

Key words：obesity；asthma；model；KM mice；C57BL/6J mice；BALB/c mice

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0288-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.027

作者簡介：陳一平(1978-)，女，博士生，研究方向：哮喘的防治，E-mail：1847860901@qq.com;李超乾(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：哮喘的防治，通訊作者，E-mail：2534776680@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81360007)

收稿日期：2015-09-22,修回日期：2015-10-28

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.054.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57

◇實驗方法學(xué)◇