韓　鈺，楊　帆，叢恬駪，孫　凱，李　燕，康　毅，尹永強，婁建石

(天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津　300070)

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薯蕷皂苷對大鼠心肌收縮力影響的研究

韓鈺，楊帆，叢恬駪，孫凱，李燕，康毅，尹永強，婁建石

(天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津300070)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.11；R331.31

摘要：目的觀察薯蕷皂苷(dioscin，Dio)對大鼠心肌收縮力的影響。方法采用 Langendorff 逆行主動脈灌流法對大鼠離體心臟進行灌流，利用壓力感受器插管法測定左心室相關心功能參數(shù)，記錄低、中和高3個濃度Dio對左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)的影響。利用激光共聚焦顯微鏡觀察Dio對H9c2細胞內Ca2+濃度的影響，并利用多功能酶標儀觀察藥物對細胞線粒體膜電位的影響。結果0.1、1 μmol·L-1Dio可明顯增加LVSP，由(11.55±0.52)、(10.53±0.28) kPa分別增加至(13.08±0.72)、(12.53±0.64) kPa(P<0.01)；增加+dp/dtmax由(0.38±0.10)、(0.40±0.07) kPa·ms-1分別增加至(0.42±0.11)、(0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05)。10 μmol·L-1Dio則使LVSP由(12.13±0.33) kPa減至(9.46±0.77) kPa(P<0.01)，使+dp/dtmax由(0.42±0.04) kPa·ms-1降為(0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01)。0.1、1、10 μmol·L-1的Dio可使H9c2細胞中Ca2+相對熒光強度由(16.62±0.89)分別增加至(21.48±0.80)、(25.68±0.69)和(19.84±0.66)(P<0.01)。0.1、1 μmol·L-1Dio對H9c2細胞線粒體膜電位無明顯影響，而10 μmol·L-1Dio會使JC-1單體與聚合物的比值由(1.14±0.03)增加為(1.35±0.06)(P<0.01)，即引起線粒體膜電位下降。結論低、中濃度Dio可增加LVSP和+dp/dtmax，表現(xiàn)正性肌力作用，機制為增加細胞內Ca2+濃度。并且，其在增加細胞內Ca2+濃度的同時并不會引起鈣超載，僅高濃度出現(xiàn)。

關鍵詞：薯蕷皂苷；Ca2+濃度；正性肌力作用；離子通道；鈉鈣交換體；左心室收縮壓

心力衰竭在臨床上可分為急性心力衰竭和慢性心力衰竭[1]，嚴重時可導致意識模糊甚至昏迷，并最終產生心源性休克。同時，心衰所致的電生理重構往往造成心肌動作電位時程延長[2-4]，繼而延長QT間期，這又會增加惡性心律失常發(fā)生的風險而誘發(fā)猝死等。故隨著人們對其危害性的普遍認知，心衰的防治策略越來越受矚目。目前，臨床上心衰的治療主要是應用地高辛、洋地黃毒苷等具有正性肌力作用的強心苷類藥物[5]，但是其在增加心肌收縮力的同時易引起室早、室速等心律失常，且增加心臟的負擔，而未能改善心衰患者的預后并降低其死亡率[6]。因此，探索更加安全有效的抗心衰藥物仍是今后研究的難點與熱點。

我們發(fā)現(xiàn)不少研究[7-10]證實，天然甾體皂苷薯蕷皂苷(dioscin，Dio)具有抗炎、抗腫瘤和抗骨質疏松等多種藥理作用。本室前期實驗研究亦發(fā)現(xiàn)Dio對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護效應[11]，而且其在細胞水平可通過調節(jié)心肌鈉、鈣等離子通道而發(fā)揮抗缺氧/復氧誘導的心律失常作用。更為重要的是，我們前期研究還發(fā)現(xiàn)其具備一定的強心作用，且尚未見文獻報道。因此，我們設想與強心苷類同屬于甾體苷類的Dio產生的正性肌力作用是否與其相同？是否比其更低毒更安全？本實驗將進行初步探索，以期揭示Dio作用特點和機制。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗對象健康、成年Wistar 大鼠，♂，體質量250~300 g，合格證號SCXK(京)2012-0004，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；大鼠心肌細胞 H9c2 細胞株，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所細胞中心。

1.1.2藥品與試劑Dio購自國家天然藥物研究中心；JC-1和Fluo3-AM 鈣離子熒光探針購自碧云天生物技術研究所。

1.1.3儀器GL-2 Langendorff 灌流裝置、BL420-F生物機能實驗系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司，中國；PHS-3C酸度計，上海精密科學儀器有限公司，中國；Millipore純水系統(tǒng)，美國；OLYMPUS全電動倒置熒光顯微鏡，日本；Gemini XPS熒光讀板機，美國。

1.1.4液體的配制K-H灌流液(mmol·L-1)：NaCl 118.06、KCl 4.69、MgSO41.18、CaCl22.5、NaHCO325、KH2PO41.18、Glucose 11.11,預充混合氧(95% O2+5% CO2)后調節(jié)pH至7.4。

1.2方法

1.2.1離體心臟Langendorff灌流法用25%烏拉坦麻醉大鼠，仰位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔，暴露心臟，從主動脈根部離斷取心臟，放入4℃生理鹽水中去除脂肪及結締組織。將主動脈逆行插管，以恒溫(37℃)、充氧(95% O2+5% CO2)的K-H液8 mL·min-1灌流，灌注壓為8~9 kPa左右。待心臟逐漸恢復跳動且殘血排盡后，剪掉左心耳，將球囊壓力感受器探頭經(jīng)左心房插入左心室。壓力感受器經(jīng)壓力換能器與 BL420生物機能實驗系統(tǒng)相連以記錄左心室收縮曲線，采樣頻率為800點·s-1。心臟灌流穩(wěn)定30 min，給藥前5 min作為空白對照，然后給予藥物干預。給藥后20 min觀察記錄左心室各項心功能指標。

1.2.2細胞內鈣離子濃度的測定以8×107·L-1的密度將細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，于孵箱中培養(yǎng)24 h后，與藥液共孵育20 min。后加入Fluo3-AM工作液負載30 min，后用臺氏液洗滌細胞3遍，向各組加入1 mL臺氏液，避光孵育20~30 min。共聚焦顯微鏡下記錄熒光信號，利用Image J軟件計算胞內平均熒光強度。

1.2.3線粒體膜電位的測定以 4~5×107·L-1的密度將細胞接種于24孔板，接種48 h后用PBS沖洗2遍,給予相應含藥培養(yǎng)基孵育20 min。后用PBS沖洗1遍，換上終濃度1.5 mg·L-1JC-1孵育20 min；孵育完成后，用PBS沖洗2遍，加入DMEM，放入酶標儀檢測熒光值。

1.2.4實驗分組① 正常對照組；② 低濃度0.1 μmol·L-1Dio組；③ 中濃度1 μmol·L-1Dio組；④ 高濃度10 μmol·L-1Dio組。

2結果

2.1Dio對大鼠離體心臟左心室各心功能指標的影響以給藥前5 min作為正常對照，采用配對t檢驗比較各組給藥前后各心功能指標差異。由BL-420系統(tǒng)記錄到的左心室壓力圖像(Fig 1)。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1Dio使LVSP明顯增加近13%和18%(P<0.01)；+dp/dtmax增加約11%和9%(P<0.05)，同時HR減慢；10 μmol·L-1Dio則使LVEDP 明顯增加(P<0.01)，而LVSP等其他指標均明顯降低(P<0.01)，且實驗過程中偶見心律失常。各濃度Dio下參數(shù)具體變化見Fig 2中給藥后各參數(shù)與正常對照的比值。

2.2Dio對大鼠心肌細胞內鈣離子濃度的影響Dio作用后Ca2+熒光強度變化如Fig 3和Fig 4所示。與正常對照組相比，0.1、1和10 μmol·L-1Dio均能使熒光強度增強(P<0.01)，其中1 μmol·L-1Dio效應最明顯，使熒光強度增加約56.25%。

2.3Dio對大鼠心肌細胞線粒體膜電位的影響Dio作用后熒光比值變化如Fig 5所示。與正常對照組相比，0.1、1μmo1·Ｌ－１Dio孵育均未引起熒光比值明顯變化（p＞ 0.05）。但10μｍｏ1·Ｌ－１Dio使該比值增加約18.42%（p＜0.01），顯示該組線粒體膜電位降低。

Fig 1　Effects of dioscin on LVSP in isolated Langendorff-perfused rat heart(1 mmHg=0.133 kPa)

Fig 2　Effects of dioscin on cardiac functions in isolated

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

A:Control； B:0.1 μmol·L-1Dio；C:1 μmol·L-1Dio；D:10 μmol·L-1Dio

Fig 4　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Effects of dioscin on mitochondrial membrane

***P<0.01vscontrol group

3討論

本實驗分別探索了Dio對心肌收縮力和細胞內Ca2+濃度的作用，低、中濃度Dio可使LVSP和+dp/dtmax明顯增加，體現(xiàn)正性肌力作用。研究證實，舒張性心力衰竭患者，左室射血分數(shù)正常而-dp/dtmax明顯降低。Dio可增加-dp/dtmax，在一定程度上改善左心室舒張功能，相較于傳統(tǒng)的正性肌力藥更有優(yōu)勢。

然而，高濃度Dio對心肌收縮力的作用卻與低、中濃度相反，使LVSP和±dp/dtmax均減小，僅增加LVEDP。在實驗過程中，在剛剛給予高濃度Dio時(5 min內)，可觀察到LVSP有所增加，但隨著灌流時間的延長，LVSP開始降低，甚至出現(xiàn)心律失常，這可能與高濃度Dio過分增加LVEDP，使得容量負荷過度有關。

心肌收縮功能與細胞內Ca2+水平密切相關[12-13]。我們由當前研究發(fā)現(xiàn)Dio的急性作用可使Ca2+熒光強度增強，這表明Dio與洋地黃強心苷類藥物作用方式相似，即通過增加心肌細胞內Ca2+濃度而發(fā)揮正性肌力作用。這引發(fā)了我們對于Dio在提升細胞內Ca2+水平的同時是否會導致鈣超載，以及其誘導Ca2+濃度增加的機制產生了思考。

首先，線粒體膜電位的測定結果顯示，低、中濃度Dio對熒光比值無明顯改變，即不由此引發(fā)細胞損傷。同時，其僅在10倍于中濃度的高濃度下才使該比值有一定升高，這與離體水平上高濃度的不良效果較為一致。但是與洋地黃毒苷類強心藥易引發(fā)心律失常，增加心臟負荷相比，Dio似乎仍顯示出更優(yōu)的安全性，因為在1 μmol·L-1濃度時，Dio增加細胞內Ca2+濃度和心肌收縮力在本實驗中最明顯，而此時并未見心律失常以及鈣超載所致的線粒體膜電位下降，顯示出Dio在發(fā)揮正性肌力作用上可能具備一定優(yōu)勢。

其次，細胞內Ca2+濃度的增加表明Dio并非如左西孟坦等鈣增敏劑，通過增加心肌收縮蛋白對Ca2+的敏感性來發(fā)揮強心作用[14]。另外，我們前期實驗又證實Dio可減少L-型Ca2+通道介導的內向鈣電流[15]，這表明L-型Ca2+通道不是Dio增加Ca2+濃度的途徑。因此，其機制有待于進一步研究。再有，我們前期結果還顯示Dio能夠增加內向鈉電流[16]。聯(lián)想到臨床上使用的洋地黃類藥物通過抑制心肌Na+-K+-ATP酶活性，使細胞內Na+增多，從而通過鈉鈣交換體(sodium-calcium exchanger，NCX)使細胞Ca2+內流增加，產生正性肌力作用[17]。Flesch等[18]也認為，鈉通道激活劑產生正性肌力作用的機制與鈉鈣交換活動增強有關。另外，進入細胞的Ca2+也可觸發(fā)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+[19]。我們據(jù)此推測，Dio增強心肌收縮力的作用可能與影響鈉鈣交換體相關。因此，下一步我們將觀察Dio是否通過上述機制增加胞內Ca2+濃度以證明我們的設想。

總之，我們證實Dio通過增加胞內Ca2+濃度產生正性肌力作用，還能改善舒張功能，僅高濃度時才產生一定的鈣超載，基本符合理想正性肌力藥的要求[20]。當然，本實驗目前僅初步發(fā)現(xiàn)Dio的正性肌力作用，還尚未對其作用原理進行深入探究，故今后我們將從多途徑，如NCX電流以及進出肌漿網(wǎng)的Ca2+濃度變化等進行觀察以闡明其機制。同時，Dio對病理情況下心肌收縮力的作用也亟待探索。

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Effects of dioscin on rat myocardial contractility

HAN Yu, YANG Fan, CONG Tian-shen, SUN Kai, LI Yan, KANG Yi, YIN Yong-qiang, LOU Jian-shi

(DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of dioscin (Dio) on rat myocardial contractility. MethodsLeft ventricular contractile function was measured using the Langendorff non-recirculating mode of isolated rat heart perfusion. Effects of low, middle and high concentration of Dio were investigated by measuring left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP). Also, peak rates of rise/fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) of isolated rat heart were calculated. Effects of Dio on intracellular free calcium concentration in rat H9c2 cells were measured by using the confocal microscopy. Mitochondrial membrane potential was detected with multifunctional microplate reader. ResultsWith 0.1, 1 μmol·L-1Dio, LVSP were significantly enhanced from (11.55±0.52), (10.53±0.28) kPa to (13.08±0.72), (12.53±0.64) kPa(P<0.01); +dp/dtmaxwere dramatically increased from (0.38±0.10), (0.40±0.07) kPa·ms-1to (0.42±0.11), (0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05). With the 10 μmol·L-1Dio, LVSP and +dp/dtmaxwere both decreased from (12.13±0.33) kPa and (0.42±0.04) kPa·ms-1to (9.46±0.77) kPa and (0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01). With 0.1, 1, 10 μmol·L-1Dio, the relative fluorescence intensity of intracellular free calcium concentrations was increased significantly from (16.62±0.89) to (21.48±0.80), (25.68±0.69) and (19.84±0.66)(P<0.01)respectively. 0.1, 1 μmol·L-1Dio showed no significant effects on the mitochondrial membrane potential of rat H9c2 cells, while with effects of 10 μmol·L-1Dio, the ratio of JC-1 monomer and J-aggregates was changed from (1.14±0.03) to (1.35±0.06)(P<0.01), indicating a decrease in the mitochondrial membrane potential. ConclusionLow and middle concentrations of Dio show a positive inotropic effect on isolated rat heart, as the LVSP and +dp/dtmaxare enhanced, which may concern with the increase of the intracellular concentration of Ca2+. It will not cause the calcium overload while the intracellular concentration of Ca2+is increased by low and middle concentration of Dio in the myocytes except high concentration of Dio.

Key words:dioscin; concentration of Ca2+; positive inotropic effect; ion channel; sodium-calcium exchanger; left ventricular systolic pressure

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0258-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.021

作者簡介：韓鈺(1990-)，男，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail:18622272148@163.com;尹永強(1980-)，男，博士，講師，研究方向：心肌細胞離子通道，通訊作者，Tel:022-83336835，E-mail:13820043633@126.com；婁建石(1954-)，男，碩士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel: 022-83336860，E-mail:jianshilou@163.com

基金項目：天津應用基礎及前沿技術研究計劃青年項目(No 14JCQNJC13700)

收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-12-02

網(wǎng)絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.042.html網(wǎng)絡出版地址：2016-1-25 15:57