韓　翰,王　敏

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)教研室、2.病原生物學(xué)教研室， 遼寧 沈陽　110034)

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SAHA和TRAIL聯(lián)合使用對乳腺癌雌激素受體陽性細胞MCF-7生長的影響

韓翰1,王敏2

(沈陽醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)教研室、2.病原生物學(xué)教研室， 遼寧 沈陽110034)

中國圖書分類號：R329.24；R392.11；R737.9；R916.4；R979.1

摘要:目的實時觀測SAHA和TRAIL聯(lián)合使用后對乳腺癌雌激素受體陽性細胞MCF-7生長的影響。方法實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析系統(tǒng)(real time cell analysis, RTCA)動態(tài)監(jiān)測各種處理因素對乳腺癌MCF-7細胞生長狀況的影響，并通過BiostationIM活細胞工作站實時收集各種處理因素對乳腺癌MCF-7細胞增殖干預(yù)的形態(tài)學(xué)證據(jù)。結(jié)果xCELLigence RTCA實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析系統(tǒng)顯示，隨著TRAIL的加入，SAHA對MCF-7細胞的抑制作用明顯增強。SAHA和TRAIL的聯(lián)合用藥可能提高了SAHA對MCF-7細胞的敏感性。實時活細胞工作站成像實驗進一步證明SAHA和TRAIL聯(lián)合用藥對MCF-7乳腺癌細胞的抑制作用強于SAHA或TRAIL單獨用藥。結(jié)論SAHA和TRAIL的聯(lián)合使用對MCF-7細胞的生長具有協(xié)同抑制作用。

關(guān)鍵詞:SAHA；TRAIL；乳腺癌；雌激素受體陽性；MCF-7；協(xié)同作用

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率已居全球女性惡性腫瘤首位[1-2]。乳腺作為一個激素反應(yīng)器官，機體內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化與乳腺發(fā)育和癌變的發(fā)生密切相關(guān)[3]。據(jù)臨床統(tǒng)計，乳腺癌患者中70%~80%為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌[4]，因此針對雌激素受體陽性乳腺癌的研究成為探究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展原因的重要內(nèi)容。

組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor, HDACi)通過阻滯細胞周期進程、誘導(dǎo)細胞凋亡與自噬的產(chǎn)生，具有較強的抗腫瘤活性[5]，與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[6]。SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是第二代氧肟酸類組蛋白去乙酰化酶抑制藥，它通過抑制HDAC活性，誘導(dǎo)靶細胞中組蛋白高度乙?；?，啟動某些特異性基因的表達而達到阻斷腫瘤生長的目的[7-8]。但也有大量研究證明SAHA濃度過高時對細胞具有較大的毒副作用，同時SAHA還存在體內(nèi)半衰期短、易代謝、長期使用會產(chǎn)生耐藥等缺點。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是1995年Wiley等[9]發(fā)現(xiàn)的一種凋亡分子，為Ⅱ型膜蛋白，屬于TNF家族。TRAIL可通過與死亡受體(death receptor, DR)DR4和DR5結(jié)合，特異性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，由于正常細胞不表達或很少表達死亡受體DR4和DR5，因此TRAIL對正常細胞的殺傷作用很小[10-12]。本文將SAHA和TRAIL聯(lián)合作用于乳腺癌雌激素受體陽性細胞系MCF-7，實時觀測SAHA和TRAIL聯(lián)合使用后對MCF-7細胞生長狀態(tài)的影響，為雌激素受體陽性乳腺癌的藥物聯(lián)合治療提供一個新的思路。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA購自美國Sigma-Aldrich公司；人重組TRAIL蛋白購自美國Peprotech公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購自美國Promega公司；Annexin-V-FLUOS staining kit試劑盒購自美國Roche公司；其他的化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MCF-7培養(yǎng)于含15%胎牛血清、1×108U·L-1的青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中。

1.2.2實時細胞增殖檢測將1×107·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于xCELLigence實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析系統(tǒng)的E-Plate 96板(Roche)各孔中，待細胞進行無血清同步化處理后，各孔分別加入SAHA(0、 0.5、1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)以及TRAIL(0、 5、10、20、30、40、50、100 μg·L-1)進行孵育，以DMSO為對照組。通過xCELLigence系統(tǒng)中各孔微電阻量的變化，動態(tài)監(jiān)測0~72 h范圍內(nèi)MCF-7細胞的生長情況，實驗重復(fù)3次。

1.2.3利用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒驗證RTCA實時分析系統(tǒng)的檢測結(jié)果將1×107·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于96孔板各孔中，細胞進行無血清同步化處理24 h后，按“1.2.2”方法加入SAHA和TRAIL共同孵育，細胞分別培養(yǎng)24、48 h后進行MTT測定，了解MCF-7細胞增殖的情況。

1.2.4實時活細胞成像將5×108·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于BioStationIM活細胞工作站μ-Slide 4 Well(Nikon)各孔中，待細胞進行無血清同步化處理后，加入SAHA和TRAIL共同孵育48 h。設(shè)定BioStationIM活細胞工作站以相差模式、總拍攝時長48 h、間隔12 h示蹤μ-Slide 各孔中乳腺癌MCF-7細胞生長狀況，實時收集各種處理因素對乳腺癌細胞增殖干擾的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1.2.5細胞凋亡熒光檢測將5×108·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于12孔板各孔中，同步化處理后，加入SAHA和TRAIL與MCF-7細胞分別孵育0、4、12、24、36、48 h。將孵育后的細胞分別加入100 μL Annexin-V-FLUOS熒光染液，室溫靜置15 min后，應(yīng)用Leica DMI6000B顯微鏡進行熒光觀察。

2結(jié)果

2.1SAHA對乳腺癌細胞增殖影響的實時測定將乳腺癌MCF-7細胞接種于96孔板中，分別與0~50 μmol·L-1SAHA共同孵育，通過xCELLigence RTCA分析系統(tǒng)中細胞指數(shù)(cell index, CI)曲線的變化，實時觀測SAHA對乳腺癌細胞生長狀態(tài)的影響。從Fig 1A可以看出，未加入SAHA的細胞，隨著時間的延長，其細胞指數(shù)曲線不斷上升，生長狀況良好，48 h即到達增殖平臺期；而經(jīng)SAHA處理的MCF-7細胞增殖均呈現(xiàn)時間、劑量依賴性抑制。低濃度SAHA(0.5 ~1.0 μmol·L-1)作用效果不明顯，細胞指數(shù)曲線維持穩(wěn)定，細胞生長狀況未受太大影響，48 h后也到達生長平臺期。當(dāng)SAHA濃度達到2.0 μmol·L-1以上時，隨著處理時間的延長、SAHA濃度的增加，乳腺癌細胞不再增殖，細胞指數(shù)曲線下降，細胞生長被抑制。其中，高濃度SAHA(20~50 μmol·L-1)作用效果明顯，孵育24 h就顯現(xiàn)較明顯的抑制效果，而當(dāng)SAHA作用時間達到48 h時，系統(tǒng)顯示此時半抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)為5.0 μmol·L-1。

同時，我們還比較了DMSO對MCF-7細胞增殖作用的影響。如Fig 1B所示，加入不同濃度的DMSO后，MCF-7細胞生長狀況基本良好，細胞指數(shù)曲線持續(xù)上升，DMSO未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性效應(yīng)。

Fig 1　Real-time cell proliferation assays of

2.2TRAIL和SAHA聯(lián)合作用對乳腺癌細胞增殖影響的實時測定為了探討TRAIL對乳腺癌細胞增殖的影響，我們將不同濃度的TRAIL(0~100 μg·L-1)與乳腺癌MCF-7細胞共同培養(yǎng)于xCELLigence RTCA系統(tǒng)中。由于MCF-7是TRAIL非敏感性細胞系，低濃度TRAIL對其無明顯的抑制作用，僅僅100 μg·L-1的高濃度TRAIL表現(xiàn)出一定程度的抑制效果(Fig 2A)。

當(dāng)我們將0~100 μg·L-1TRAIL和5 μmol·L-1SAHA聯(lián)合作用MCF-7細胞24 h時，其細胞指數(shù)急劇下降到基線底端(Fig 2B)，表示此時MCF-7細胞已基本死亡；而單獨5 μmol·L-1SAHA處理24h的MCF-7細胞指數(shù)曲線才開始下降(Fig 1A)。因此，這一結(jié)果提示TRAIL的加入可能提高了SAHA對MCF-7細胞的藥物敏感性。

我們通過MTT法進一步確認(rèn)RTCA實時分析系統(tǒng)的檢測結(jié)果(Fig 2C、2D)，結(jié)果顯示100 μg·L-1TRAIL與5 μmol·L-1SAHA聯(lián)合作用24 h可產(chǎn)生最佳的抑制MCF-7細胞生長效應(yīng)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3TRAIL和SAHA聯(lián)合作用對乳腺癌細胞形態(tài)的影響為了收集SAHA、TRAIL等處理因素對MCF-7細胞增殖干擾作用的形態(tài)學(xué)證據(jù)，我們應(yīng)用BioStationIM活細胞工作站觀察SAHA、TRAIL對乳腺癌MCF-7細胞生長狀況的影響。結(jié)果如Fig 3、4所示，隨著時間的推移，DMSO對照組的細胞形態(tài)正常，生長狀況良好，24 h時達到90%鋪滿率；而單獨TRAIL、SAHA處理后的乳腺癌細胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)學(xué)改變。單獨SAHA處理后24 h出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，細胞變長，細胞質(zhì)呈放射狀向外突出，細胞生長受到抑制，熒光顯微鏡下出現(xiàn)一些形態(tài)完整、大圓型的凋亡熒光細胞。而單獨TRAIL處理對MCF-7細胞形態(tài)學(xué)影響不如SAHA效果明顯，處理36 h才發(fā)生較明顯的形態(tài)學(xué)改變，而熒光顯微鏡下呈現(xiàn)的是形態(tài)不完整、大小不一的小圓形熒光細胞。SAHA和TRAIL聯(lián)合作用12 h后MCF-7就發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，細胞核固縮，梭形細胞變多，48 h后細胞幾乎全部死亡，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)大量片狀熒光染色的凋亡細胞。

3討論

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康，甚至危及生命的最常見惡性腫瘤之一。在乳腺細胞功能異常時，HDAC的活性明顯增強，組蛋白處于低乙?；癄顟B(tài)，基因表達平衡狀態(tài)被破壞，使一些調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡的基因失活，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[13]。研究表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA具有良好的抑制腫瘤生長的作用[14]，可誘導(dǎo)MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SKBr-3等多種乳腺癌細胞凋亡的產(chǎn)生。但同時SAHA也具有毒副作用大、體內(nèi)半衰期短、易代謝和易產(chǎn)生耐藥等缺點[15]。因此，亟待我們尋找提高SAHA敏感性，降低其耐藥性的新途徑。

Fig 2　Real-time cell proliferation assays of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

Fig 3　The microscopic observation of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

TRAIL可特異性地抑制腫瘤細胞的生長，對正常細胞無明顯毒副作用，具有良好的臨床應(yīng)用價值。因此我們在細胞水平上將SAHA與TRAIL聯(lián)合作用于乳腺癌細胞，研究其協(xié)同作用對乳腺癌細胞增殖的影響，為將這兩種藥物更好地應(yīng)用于臨床提供支持。

本研究發(fā)現(xiàn)，單獨SAHA對乳腺癌MCF-7細胞增殖有較強的抑制作用，并且這種抑制作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。隨著處理時間的延長、SAHA濃度的增加，乳腺癌細胞指數(shù)曲線下降，細胞生長被抑制。其中，濃度大于20 μmol·L-1的SAHA作用效果明顯，孵育24 h就顯現(xiàn)較明顯的抑制效果，而濃度低于1.0 μmol·L-1的SAHA作用效果不明顯，細胞指數(shù)曲線維持穩(wěn)定，細胞生長狀況未受太大影響。系統(tǒng)顯示，當(dāng)SAHA作用48 h時IC50達到最大值，此時所對應(yīng)的濃度為5.0 μmol·L-1。

單獨TRAIL處理對MCF-7細胞無明顯的抑制作用，但將SAHA和TRAIL聯(lián)合應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)，兩種處理因素作用24 h即可使MCF-7細胞指數(shù)曲線急劇下降到基線底端，細胞幾乎全部死亡，聯(lián)合用藥提高療效達50%以上。活細胞工作站成像顯示，聯(lián)合用藥12 h MCF-7細胞就發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，細胞核固縮，梭形細胞變多，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)大量片狀熒光染色的凋亡細胞。這說明TRAIL的加入提高了SAHA對MCF-7細胞的敏感性。另外，由于在本實驗中原本需要濃度20 μmol·L-1的SAHA作用24 h才能明顯抑制MCF-7細胞的生長，而正是由于TRAIL的加入，在12 h的聯(lián)合處理時間內(nèi)，濃度為5 μmol·L-1的SAHA就可明顯抑制MCF-7的生長，這也說明TRAIL的加入降低了SAHA的用藥濃度，也就減少了SAHA的毒性作用。由于TRAIL本身具有對正常細胞低毒性的特點，SAHA和TRAIL對乳腺癌細胞生長的協(xié)同抑制作用也為臨床上治療乳腺癌提供了一個新的方案。

Fig 4　The fluorescent detection of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

綜上所述，SAHA聯(lián)合TRAIL的使用改變了TRAIL單獨使用效果不佳、對某些細胞不敏感的缺點，同時又避免了高濃度SAHA對乳腺癌細胞的毒副作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用可提高療效，具有明顯的協(xié)同殺傷乳腺癌細胞的作用，但是兩者聯(lián)合抑制MCF-7細胞增殖的分子機制還有待我們進一步研究。

(致謝：本實驗內(nèi)容在沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室完成，特此表示感謝！)

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Effects of combination treatment with SAHA and TRAIL on ER positive breast cancer cell MCF-7

HAN Han1, WANG Min2

(1.DeptofBiochemistry,2.DeptofPathogenicOrganism,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of combined treatment of SAHA and TRAIL on human breast cancer ER positive cell line MCF-7. MethodsMCF-7 cells were treated with SAHA and/or TRAIL. The inhibitory rates were detected by real-time cell proliferation assays. Morphology changes of MCF-7 cells were observed through time-lapse live cell imaging acquisition. ResultsReal-time cell proliferation assays showed that the anti-tumor efficacy of SAHA was significantly enhanced in combination with TRAIL. The results of time-lapse live cell imaging acquisition demonstrated that, with treatment of SAHA and TRAIL, the growth inhibition of MCF-7 cells was more obvious than that of in TRAIL or SAHA treatment alone. ConclusionThe combination treatment of SAHA and TRAIL has a synergistic effect of growth inhibition on breast cancer MCF-7 cells.

Key words:SAHA; TRAIL; breast cancer; ER positive; MCF-7 cell; synergistic effects

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0223-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.015

作者簡介:韓翰(1982-)，女，博士，講師，研究方向：抗癌藥物分析，Tel：024-62215669， E-mail：hanhan82831@163.com；王敏(1966- )，女，碩士，副教授，研究方向：腫瘤調(diào)控，通訊作者, Tel：024-62215670， E-mail：lilywangmin@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81172509)；沈陽醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金(No 20135061)

收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-11-16

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.030.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57